蚕豆投食对罗非鱼肝损伤与非特异性免疫功能的影响

　　罗非鱼是我国淡水养殖的主要水产品之一。研究表明， 投喂蚕豆可使罗非鱼肉质变紧硬而爽脆，不易煮烂，切成鱼丝不易拉断，韧性和咀嚼性增加，风味独特，是改善罗非鱼肉质的一种独特方式，有利于罗非鱼加工和出口，显着提高了养殖的经 济 效 益 （ 伦 峰 ,2006;Grigorakis 和 Alexis,2005）。而目前有关投喂蚕豆对鱼体免疫力影响的研究却鲜见报道。本试验用浸泡蚕豆、配合饲料饲养罗非鱼， 研究投喂蚕豆对罗非鱼肝损伤及非特异性免疫功能的影响， 以期为更合理使用蚕豆进行肉质脆化提供理论参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 试 验 材 料 试 验 用 新 吉 富 罗 非 鱼 （NEWGIFT,Oreochromis niloticus）由福建省淡水水产研究所榕桥试验基地提供， 初始体重为 （118.62±10.28）g,每桶放养 10 尾。

　　1.2 试验设计 试验设两个处理：试验组投喂浸泡蚕豆，对照组投喂配合饲料，每组设 3 个重复。

　　饵料营养水平测定值如表 1 所示。

　　1.3 饲养管理 试验在玻璃钢圆桶中进行，每个圆桶内径 100 cm,高度 90 cm,水深 60 ~ 70 cm,使用小循环系统使其保持微流水状态。 试验开始前，罗非鱼用 3%食盐水消毒后放入暂养池，进行为期 7 d 左右的适应性驯化， 待鱼适应后正式试验。 采取固定人员专门管理：

　　（1）饲料和蚕豆严格按组投喂，投喂前将蚕豆于 1%食盐水中浸泡 24 h. 每日投饵 2 次，投喂时间一般为上午 7∶00 ~ 7∶30,下午 17∶00 ~ 17∶30.投饲量根据鱼摄食状况而定， 一般为鱼体重量的3% ~ 4%,详细记录各组别的实际投饵量。

　　（2）每天定时测定水温。 溶解氧，记录鱼活动情况，试验期间水温维持在 26.0 ~ 31.5 ℃，溶解氧 5.0 ~ 7.0 mg/L（3）试验用水为经过曝气的自来水，每天进行加换水，排污，一般每天换水量在 30% ~ 40%,试验时间为 60 d.

　　1.4 样品采集 试验期满罗非鱼禁食 24 h 后 ,参考白洁（2008）的方法适当修改，每桶取样 5 尾，用一次性注射器进行心脏采血，置于 1.5 mL 离心管内，于室温下静置 2 h,然后放到 4 ℃冰箱 16 h,再以 2500 r/min 离心析出血清，-40 ℃保存，备用待测。

　　1.5 测定指标和方法 天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、腺苷脱氨酶（ADA）、乳酸脱氢酶 （LDH）、 酸性磷酸酶 （ACP）、 碱性磷酸酶（AKP）、髓过氧化物酶 （MPO）、溶菌酶 （LSZ）均采用试剂盒测定， 测试盒购自南京建成科技有限公司，具体操作方法及计算方法参照试剂盒说明书。

　　1.6 数据统计与分析 试验结果采用 “平均值±标准差” 表示。 用 SPSS 17.0 对数据进行方差分析，显着性水平为 0.05.

　　2 结果与分析

　　2.1 投喂蚕豆对罗非鱼肝损伤的影响 由表 2 可见， 投喂蚕豆组的罗非鱼血清 AST、ALT 和 ADA活性分别较对照组提高 13.67%、12.93%、19.12%（P < 0.05），LDH 活性无显着变化（P > 0.05）。

　　2.2 投喂蚕豆对罗非鱼非特异性免疫功能的影响 由表 3 可见，投喂蚕豆组的血清 ACP 和AKP活性与对照组相比， 分别降低 22.96%、19.70%（P < 0.05），MPO 和 LSZ 活性虽也下降， 但差异不显着（P > 0.05），说明长期投喂蚕豆一定程度上降低了罗非鱼非特异性免疫功能。

　　3 讨论

　　3.1 投喂蚕豆对罗非鱼肝损伤的影响 天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）是水产动物血清中两种重要的转氨酶。在正常代谢过程中，血清中 AST 和 ALT 活性值都会维持一定水平，当机体组织中毒、发生病变，或者受损伤的组织范围较大，可引起血清中 AST 和 ALT 浓度上升，活性突然持续性增强。 当肝细胞受到外来物质的损伤时，细胞膜的通透性加大，大量 ALT 和 AST 渗入血液，肝的 ALT 和 AST 活性明显下降，而血液中ALT 和 AST 活性升高（陈鹏飞等，2005）。 血清腺苷脱氨酸（ADA）主要来源于肝脏，因其为肝细胞的胞浆酶，所以任何原因所造成的肝细胞损伤，其肝细胞膜的通透性均会增强，致使血清中的 ADA酶的活性升高， 故该酶可以作为反映肝实质损伤的指标。 乳酸脱氢酶（LDH）是糖的无氧酵解和糖异生的重要酶系之一，广泛存在于心脏、肝脏、肺以及其他各组织内， 组织一经损伤血清中该酶即见升高，肝细胞损伤或者坏死后，会向血液释入大量的 LDH（贺丽虹等，2004;惠天朝等，2000）。

　　本试验发现， 投喂蚕豆使得鱼体血清中肝损伤指标 AST、ALT 和 ADA 活性显着上升， 可能是肝细胞膜功能的完整性遭到破坏， 影响膜的流动性和其他各项功能，进而损害了罗非鱼肝脏功能，这可能是蚕豆中的某种特殊化学因子起作用导致的。而 LDH 活性在试验期内与对照组相比变化不大，原因有待进一步研究。

　　3.2 投喂蚕豆对罗非鱼非特异性免疫功能的影响 鱼类为较低等变温脊椎动物， 其特异性免疫应答相对低下， 而非特异性免疫系统在其防御病原体感染中具有非常重要的意义 （Tonya 等，2000）。 酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、髓过氧化物酶（MPO）、溶菌酶（LSZ）是评价鱼类非特异性免疫力的常用指标。 其中，ACP 是水产动物体内公认的巨噬细胞溶酶体的标志酶， 在体内直接参与磷酸基团的转移和代谢， 其活力的高低反映了巨噬细胞的激活程度（李丽娟等，2013）。同时，ACP 也是吞噬溶酶体的重要组成部分， 在血细胞进行吞噬和包囊反应时，会释放酸性磷酸酶。

　　AKP 是磷酸酶的一种，血清中的 AKP 主要来源于肝脏和骨骼，能将对应底物去磷酸化，生成磷酸根离子和自由的羟基， 直接参与磷酸基团的转移，以及钙磷代谢。碱性磷酸酶能够通过改变病原体的表面结构， 增强机体对病原体的识别和吞噬能力，起调理素的作用，加速吞噬细胞的吞噬和病原体的降解速度，进而提高鱼体的抗病力，可作为机体免疫标志酶（王玲等，2008）。

　　MPO 是鱼体内一种重要的氧化酶，它是由中性粒细胞、 单核细胞和某些组织的巨噬细胞分泌的血红素蛋白酶， 主要存在于嗜中性粒细胞和单核细胞中。 吴越等（2005）研究表明，MPO 能催化过氧化氢与氯反应，产生次氯酸，具有很强的抗微生物作用，可直接影响机体的免疫功能。

　　LSZ 是水产动物体内一种重要的非特异性免疫因子，存在于鱼体的吞噬细胞和血清中，对病原体有重要的防御作用。溶菌酶在机体免疫过程中，通过催化水解细菌细胞壁黏肽的乙酰胺基多糖，导致细菌裂解死亡。 同时能清除其他抗菌因子作用后所残余的细菌细胞壁， 并增强其他免疫因子的抗菌敏感性， 诱导调节其他免疫因子的合成与分泌， 共同抵制外来病原的入侵 （叶丹和连宾，2003）。鱼类血清溶菌酶活力的高低是衡量机体免疫状态的指标之一。血清溶菌酶活力提高，其免疫能力也相应提高。相反，鱼类血清溶菌酶的活性降低，机体免疫力降低。

　　本试验中，与普通配合饲料相比，用浸泡蚕豆投喂罗非鱼后，鱼体的非特异性免疫力降低，特别是 ACP 和 AKP 指标显着降低， 可能是由于蚕豆适口性差，以及抗营养因子（蛋白酶抑制剂、单宁等） 的存在。 用蚕豆作为单一饵料脆化罗非鱼肉质，鱼体摄食量减少，营养不平衡，胃肠道各种消化酶活力降低， 对营养物质的消化吸收及利用能力也降低， 使得脆化期间鱼体所需营养得不到满足，从表观上看，鱼体的生长受到抑制，同时，各种非特异性免疫酶的合成和分泌受到了抑制， 降低了鱼体的免疫力， 削弱了鱼体的抗病能力。 而MPO 和 LSZ 活性虽也有下降趋势， 但差异不显着，原因可能是试验时间还不够长，有条件的话，将做重复试验，延迟试验时间至 90 d.

　　4 结论

　　本试验结果表明， 以浸泡蚕豆饲养新吉富罗非鱼，虽可明显脆化罗非鱼肉质，但却一定程度上造成鱼体肝脏的损害， 降低鱼体非特异性免疫功能。

　　参考文献

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　　[2] 陈鹏飞，杨德强，邹红。两种中草药组方对鲫鱼肝脏转氨酶的影响[J].饲料工业，2005,6:28 ~ 31.

　　[3] 贺丽虹，孙绍永，黄建华。多糖在水产动物免疫促进方面的研究进展[J].河北渔业，2004,1（133）：1 ~ 2.

　　[4] 惠天朝，施明华，朱荫媚。硒对罗非鱼慢性镉中毒肝抗氧化酶及转氨酶的影响[J].中国兽医学报，2000,20（3）：264 ~ 266.

　　[5] 伦峰。蚕豆脆化草鱼、罗非鱼肉质的研究：[硕士学位论文][D].上海：上海水产大学，2006.

　　[6] 李丽娟，龚全，权可艳，等。壳聚糖对黄颡鱼生长和非特异性免疫机能的影响[J].西南农业学报，2013,26（6）：2614 ~ 2619.

　　[7] 王玲，胡俊杰，郭延生，等。中药免疫增强剂的研究进展及其在水产养殖中的应用[J].中国饲料添加剂，2008,3:36 ~ 39.

　　[8] 吴越，王典，于晓军。髓过氧化物酶及其多态性与疾病的研究进展[J].免疫学杂志，2005,21（3）：89 ~ 92.

　　[9] 叶丹，连宾。溶菌酶及其应用[J],贵州科学，2003,21（3）：67 ~ 70.