利用酶工程技术治理白色污染

　　摘    要：　白色污染是当今全球面临的主要问题之一，其对环境，动物和人类都有很大的影响。目前，人类对塑料制品垃圾的处理方法存在许多不足。而酶工程是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学的结合体，利用酶的专一性、高效性，在白色污染的生物治理方面将有巨大的可发展空间。Ideonella sakaiensis降解塑料的分子机理的阐明、聚对苯二甲酸类塑料降解酶(PETase)结构解析及定点突变实验，表明酶工程在白色污染治理方面的应用具有重要的价值。

　　关键词：　白色污染; 酶工程; I. sakaiensis; PETase;

　　前言

　　白色污染是全球性热点问题。自2008年6月1日我国实施“限塑令”以来，部分地区“白色污染”问题得到较大的改观。然而，随着快递，外卖等行业的发展，产生了大量废弃塑料，其产生量每年约以10%的速度增长。到2020年，估计将突破一亿吨。总体上，由于涉及生产，流通，回收等环节和生产商，销售商，零售商等主体，“限塑令”的实施并未取得良好效果[1,2,3]。

　　酶工程技术在近年来取得了较大发展[4]，利用酶工程技术有望在白色污染治理方面取得成功。日本科学家Shosuke Yoshida等，在以聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)为主要原料的废品回收地，筛选出可分泌PETase的Ideonella sakaiensis 201-F6菌株(I.sakaiensis)[5]。北京航空航天大学杨军研究组和美国斯坦福大学吴唯民高级研究员、深圳华大基因公司赵姣博士等研究人员，在黄粉虫肠道中分离出可利用聚苯乙烯(PS)的微小杆菌YT2(Exiguobacteriumsp.YT2)[6,7]。另外，在生活中也存在很多可降解塑料的现象。如，家中储藏的大米中滋生的昆虫能咬破塑料袋、黄粉虫常在堆放塑料的垃圾堆旁生长，海洋中的蛀船虫和钻孔蚌能侵蚀聚乙烯和海底电缆等。

 

　　一、白色污染

　　(一)白色污染简介

　　白色污染由聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯(图1)等高分子化合物制成的包装袋、农用地膜、一次性餐具、塑料瓶等固体塑料产品，经过使用、丢弃后，形成的固体废物[8]。难以降解的塑料制品被随意的乱扔乱丢，最终会形成对景观和生态环境的严重污染。由于高分子化合物优良的化学稳定性，塑料在常温环境条件下降解，大约需要200年时间，导致其产生巨大的危害[9]。在生态环境中的废旧产品塑料包装，一方面，会影响自然景观和城市面貌，造成“视觉污染”；另一方面，由于其难以降解，还会对生态环境形成潜在的危害。如，农作物对养分和水分的吸收会被混在土壤中的塑料影响，最终导致农作物的减产[10]；地下水会被渗出的增塑剂和添加剂污染；人体健康会被焚烧产生的有害气体损害；土地资源也会因为填埋处理造成长期的浪费[11]。

　　图1 高分子化合物结构式

　　(二)目前白色污染处理方法

　　我国目前处理废弃塑料的方法众多，包括：1.熔融再生：像聚酯饮料瓶、食品包装袋等比较干净、单一，便于清洗的一次性使用废弃物或者在生产过程中的边角废料。由于其本身比较干净，且组成成分单一，再生塑料可以把这些塑料通过简单的熔融再生获得。其性能达标可以作为新料使用。2.燃烧取热：采用这种工艺不必对塑料进行预先的处理。通过这种方法在体积上可以减少90%以上，质量上可以减少80%以上。这是由于每公斤废弃塑料含能量可以达到17.88～45.62MJ。3.热解回收油气：热分解可分为高温分解和低温催化分解，分别在600～900℃，以及低于450℃，大约300℃时完成。热的分解所得的产物分别为燃料气、氯化氢、活性炭、树脂或油品。依据这些不同产物的不同形状，可以将热分解分为气化、碳化工艺和油化[12]。4.填埋处理：这种方法简便，经济效果好。但是，当前土地资源紧张，而被废弃塑料占据的填埋场难以得到最大化的利用，会造成土地资源的严重浪费。另外，被填埋的塑料难以分解，也是隐藏的祸患[13,14]。

　　以上这些方法都存在许多不足。如，不同区域、不同方法，不同人收集上来的废弃塑料。其中，包含的种类很杂，且含有很多的杂质与复杂的污染物。这些因素都会限制塑料的再利用。如果为了进行熔融再生而对其进行统一分类，会消耗大量的人力、物力和财力。而即便通过这种方法得到再生塑料，其性能与新塑料相比，也相差较多，无法进行有效的利用。对塑料进行燃烧，会因其中含有的氯元素及苯基等高不饱和度基团，导致燃烧不充分，从而产生有害气体，污染大气。

　　二、酶工程

　　(一)酶工程简介

　　酶工程是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学的结合体。常用的三种方法分别为：利用基因工程生产大量的酶、对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶、设计新酶基因，产生自然界不曾有的新酶。

　　(二)酶工程的应用

　　由于酶工程的技术性不断得到突破，其应用越来越广泛。如，酶工程被广泛应用在遗传育种、医药卫生、食品工业、农业、轻化工业、能源的开发及环境工程等方面[15,16,17]。由于有些酶或者同工酶可以作为动物遗传标记，用于估计种群间的亲缘关系，作为品种的遗传标记，品种形成的分析，亲子关系的鉴别等。应用同工酶作为遗传标志受到畜牧业工作人员的重视。例如，碱性磷酸酶同工酶与母鸡的产蛋性能具有密切的关系、利用血清同工酶谱的改变诊断癌瘤、用同工酶谱的比较确定植物杂交育种后，是否出现新品种等[18]。在环境工程中，酶工程主要用于工业废水和生活污水的净化，作为保护自然的一项措施，具有十分重要的意义。

　　三、利用酶工程技术治理白色污染

　　(一)以塑料为碳源的昆虫和微生物

　　研究发现，有很多昆虫或微生物能把塑料作为碳源，提供自身需求的能源。西班牙一位生物学家Federica Bertocchini研究发现：蜡虫，即印度谷螟幼虫，是同翅目、蜡蚧科昆虫。它们能通过咀嚼和进食聚乙烯(PE)薄膜，为自身的生长提供碳源。研究人员在其幼虫的肠道当中，分离出能降解PE薄膜的两种菌株，即肠杆菌属的YT1和芽孢杆菌YP1。YT1与YP1中的酶可以将高聚物PE降解。杨军教授等研究了黄粉虫对聚苯乙烯的生物降解和完全矿化作用(图2A)[19]。黄粉虫，鞘翅目，拟步行虫科昆虫。黄粉虫有4个生活阶段：卵、幼虫、蛹和成虫。黄粉虫在其1个月的幼虫阶段,可将聚苯乙烯泡沫塑料作为唯一食源，在成虫阶段将其所啮食的PS降解矿化为CO2或同化为虫体脂肪。研究组对其肠道微生物进行了详细分析，并从肠道中分离出聚苯乙烯降解细菌YT2。这种细菌为革兰氏阳性菌，它们可以将聚苯乙烯作为唯一碳源，保证自身的生长。YT2可以将摄食的碎片解聚成小分子化合物，进而同化为黄粉虫自身的组织。日本京都工艺纤维大学的Kohei Oda和庆应义塾大学的Kenji Miyamoto对日本一家PET(图2B)塑料瓶回收工厂的250份土壤、废水和沉淀物的样本进行了分析。该研究组从样本中筛选出的革兰氏阴性菌株I.sakainesis可以黏附在塑料薄膜上。研究发现，它可以通过自身分泌出PETase和MHETase，逐步将PET降解为乙二醇和苯二甲酸。

　　图2 A:正在吃塑料的黄粉虫；B：聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)分子式

　　(二)酶工程的应用

　　昆虫或微生物对塑料的利用均是通过酶对塑料的催化降解实现的。由昆虫或微生物产生的天然酶具有活性低、产量少、稳定性差等缺点，可以通过酶工程的技术，对酶基因进行定点突变，并重组至质粒。然后，转入宿主菌进行过量表达、分离纯化。

　　中国科学院天津工业生物技术研究所郭瑞庭研究员带领的结构生物学与蛋白酶学研究团队利用X-ray衍射技术，成功解析了PETase的高分辨率结构(图3A)。同时，还获得了PETase双突变体R103G/S131A与底物类似物p-nitrophenol(p-NP)和1-(2-hydroxyethyl)4-methyl terephthalate(HEMT)的复合体结构(图3B、C)[20]。科研人员通过整体的蛋白质结构比对发现，PETase是属于α/β-水解酶家族的蛋白，拥有α/β-水解酶家族蛋白的典型结构特点[21]。

　　图3:A:PETase的高分辨率结构(PDB ID:5XG0);B:α/β-水解酶家族蛋白的二级结构示意图；C:PETase双突变体R103G/S131A与p-NP的复合体结构(PDB ID:5XH2);D:PETase双突变体R103G/S131A与HEMT的复合体结构(PDB ID:5XH3)

　　根据以上结果，Harry P.Austin等对PETase特定位点的氨基酸进行突变，得到W159H/S238F双突变的酶，相较于野生型的PETase，其对底物的水解能力有明显的增加，稳定性也有所提高,也能有效降解PET的替代品聚乙烯(PEF)。这些研究成果从分子层面上阐明了PETase的降解机理，为降解以PET为原料的塑料打下了坚实的基础。我们利用PETase的蛋白骨架进行相关方面的酶学研究具有重要的指导意义，对自然环境中PET生物降解过程的理解具有促进作用。从而根据自然环境中的生物降解过程，通过酶的定点突变，加快改善PETase的进化，促进PET水解酶的开发与利用，最终实现对PET或其他塑料的快速降解[22]。

　　四、总结与展望

　　酶工程技术已在多方面得到了成熟的应用。研究人员对蜡虫，黄粉虫以及I.sakainesis的研究表明，酶工程技术也可以用于治理白色污染。针对现有不同塑料的种类，从不同的生物体中开发出高水解活性的酶类。从而达到环保、高效的降解塑料，产生可再次利用的小分子化合物，最终形成资源的良性循环利用。

　　目前，还存在许多问题。如，生物体代谢塑料的详细途径还有待进一步研究。途径中涉及到针对塑料降解的酶类的结构生物学研究还有待进行。这些问题的存在，导致了即便现有的水解酶有活性低，稳定性差的缺点，但也不能利用酶工程技术在结构上进行有针对性的设计，即使能设计出，但效果距离试剂应用还存在较大距离。

　　针对塑料的降解，将来需要系统的完成酶水解各种不同塑料的分子机理研究。从而设计出针对不同塑料的高效水解酶，甚至是可同时水解多种塑料的广谱高效水解酶。

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