观察parkin对阿尔茨海默病转基因果蝇模型的保护作用

　　阿尔茨海默病( Alzheimer's disease，AD) 是一种最常见的老年痴呆类型，其特征性病理学改变主要为 Tau 蛋白、β 淀粉样蛋白的沉积等。该疾病的临床表现主要为进行性认知功能障碍，可伴有震颤麻痹和肌萎缩等帕金森相关症状。有研究报道，Tau 蛋白相关疾病的患者伴有帕金森疾病相关蛋白 parkin 的突变。parkin 蛋白由 PARK2 基因编码，具有 E3 泛素 － 蛋白连接酶活性，泛素 － 蛋白酶体系统通过处理丧失正常功能的蛋白质从而作为细胞质量的控制系统。该研究探讨 parkin 对 AD 的作用，采用遗传干预使 dparkin 在 ninaE-GAL4 /UAS 系统的 AD 转基因果蝇模型视网膜光感受神经元中表达，观察 parkin 对 AD 转基因果蝇模型是否具有保护作用，并进一步验证这种保护作用是否与线粒体分裂基因 Drp1 有关。

　　1 材料与方法

　　1． 1 材料 果蝇品系: UAS-dparkin、w1118、UAS-Drp1 RNAi、ninaE-GAL4 购自美国 Bloomington 果蝇中心; 模型 UAS-hTauR406W购自美国哈佛大学; 双平衡系果蝇 sco/CyO; TM3/TM6 由中南大学医学遗传学国家重点实验室惠赠。

　　1． 2 方法

　　1． 2． 1 果蝇杂交

　　1． 2． 1． 1 构建 w1118 / + ; ninaE-GAL4 / + 的果蝇将 w1118 的处女蝇与 ninaE-GAL4 的雄性果蝇杂交，收取 F1 代，即基因型为 w1118/ + ; ninaE-GAL4/ +的目的果蝇。即正常对照果蝇。

　　1． 2． 1． 2 构建 ninaE-GAL4 /CyO; UAS-hTauR406W/TM3 的果蝇 将 ninaE-GAL4 处女蝇与 sco / CyO;TM3 / TM6 雄性果蝇杂交，构建基因型为 ninaE-GAL4 / sco; + / TM3 的果蝇; 同时将 UAS-hTauR406W处女蝇与 sco/CyO; TM3/TM6 雄性果蝇杂交，构建基因型为 + /CyO; UAS-hTauR406W/ TM6 的果蝇; 最后将 ninaE-GAL4/sco; + /TM3 的处女蝇与 + /CyO;UAS-hTauR406W/ TM6 雄性果蝇杂交，筛选卷翅且短刚毛的子代，即基因型为 ninaE-GAL4/CyO; UAS-hTauR406W/ TM3 的目的果蝇。即 AD 转基因果蝇模型。

　　1． 2． 1． 3 构建 dparkin 对 AD 转基因模型干预的果蝇将 UAS-dparkin/CyO 的处女蝇与上述构建的ninaE-GAL4 / CyO; UAS-hTauR406W/ TM3 的雄性果蝇杂交，筛选基因型为 ninaE-GAL4/ UAS-dparkin;UAS-hTauR406W/ + 的目的果蝇。 即 ninaE-GAL4 /UAS-dparkin; hTauR406W/ + 果蝇。

　　1． 2． 1． 4 构建 dparkin 及 Drp1 RNAi 对 AD 转基因模型干预的果蝇 利用 UAS-dparkin/UAS-dparkin的处女蝇与双平衡系果蝇 ( 基因型为 sco/CyO;TM3 / TM6) 的雄性果蝇杂交，挑选出基因型为 UAS-dparkin / sco; + / TM3 的果蝇; 用 UAS-Drp1 RNAi 的果蝇品系的处女蝇与双平衡系果蝇进行杂交，筛选出基因型为 + /CyO; UAS-Drp1 RNAi/TM6 的果蝇;最后用 UAS-dparkin/sco; + /TM3 处女蝇与 + /CyO;UAS-Drp1 RNAi / TM6 雄性果蝇杂交，筛选出基因型为 UAS-dparkin/CyO; UAS-Drp1 RNAi/TM3 的目的果蝇。

　　用已构建好的 ninaE-GAL4/CyO; UAS-hTauR406W/ TM3 处女蝇与 UAS-dparkin / CyO; UAS-Drp1 RNAi / TM3 雄性果蝇杂交，在后代挑选出不带卷翅，不带短刚毛的雄性目的果蝇。即基因型为 ni-naE-GAL4 / UAS-dparkin; hTauR406W/ UAS-Drp1 RNAi果蝇。

　　1． 2． 2 数据采集

　　1． 2． 2． 1 观察果蝇复眼形态并拍照 运用奥林巴斯体视显微镜观察第 7 天的雄性目的果蝇复眼结构，并且在电镜下进一步观察果蝇复眼的形态改变。

　　1． 2． 2． 2 检测线粒体三磷酸腺苷 ( adenosinetriphosphate，ATP) 浓度 取第 7 天的 w1118 / + ; ni-naE-GAL4 / + 果 蝇 ( 正常对照组 ) ，ninaE-GAL4 /CyO; UAS- hTauR406W/ TM3 果蝇 ( 疾病模型组) ，ni-naE-GAL4 / UAS-dparkin; UAS-hTauR406W/ + 果蝇 ( 基因 干 预 组 ) ， ninaE-GAL4/UAS-dparkin; UAS-hTauR406W/ UAS-Drp1 RNAi 果蝇( 基因干预组) 各 50只雄性果蝇，切取果蝇头部; 分别将果蝇在液氮中进行研磨，并加入 200 μl HCLO4，研磨完成后在离心机用3 500 r/min离心 15 min，取上清液，缓慢加入0. 2 mol / L KOH，调节样品 pH 至 7． 5，运用离心机3 500 r / min，离心 15 min，取上清液至新的 EP 管中，样品制备成功; 将样品在高效液相色谱仪上进行果蝇样品 ATP 值检测。该试验重复至少 3 次。

　　1． 3 统计学处理 采用 SPSS 17. 0 统计软件进行分析，数据以珋x ± s 表示，采用配对 t 检验分析。

　　2 结果

　　2． 1 dparkin 对 AD 转基因果蝇模型的影响 正常对照组果蝇复眼结构完整，纹路清晰。AD 转基因果蝇模型复眼外形不规则，纹路消失，面积较前者明显减小，见图 1。dparkin 对疾病模型干预后，果蝇复眼较模型呈现明显的好转，复眼面积明显增大，纹路较清晰，见图 2。AD 转基因果蝇模型与正常对照组比较，其 ATP 浓度明显降低，见图 3。dparkin 干预疾病模型后，其 ATP 水平较前者明显升高。见图 4。
 

　　2． 2 Drp1 RNAi 干预后，dparkin 对 AD 转基因果蝇模型的影响 Drp1 RNAi 干预后，dparkin 对 AD转基因果蝇模型的神经变性抑制作用减弱，出现。

　　3 讨论

　　AD 是一种常见的神经系统变性疾病，据统计，在全部痴患者中，AD 占一半及以上，已严重影响了患者的身心健康和生活质量。由于该病的病因及发病机制尚未完全阐明，所以临床上亦无特效治疗药物。目前国内外对 AD 研究热点主要集中在: β-淀粉样蛋白、Tau 蛋白。Tau 蛋白是微管相关蛋白( microtubule associated proteins，MAPs) 的组分之一，MAPs 与微管蛋白组成微管，后者是神经元骨架蛋白的重要成分，参与胞体和轴突营养的输送。而AD 患者脑中的 Tau 蛋白则异常过度磷酸化，并使其丧失正常生理功能。

　　人类的 Tau 蛋白有很多突变位点，其中突变频率最高的为 R406W。将人类 R406W 突变位点转入果蝇，形成 UAS-hTauR406W转基因果蝇。果蝇 GAL4系统和 UAS 系统是两个独立的系统，杂交前 UAS下游的基因处于沉默状态，杂交后 UAS 下游基因被激活。ninaE-GAL4 启动子在果蝇复眼视网膜光感受器特异性表达，启动 UAS-hTauR406W转基因果蝇后，使疾病模型的果蝇复眼视网膜光感受神经元显著变性，复眼结构几乎完全被破坏。

　　parkin 是一种与帕金森病相关的 E3 泛素连接酶，以点状沿微管分布，与微管紧密结合，从而有利于发挥 E3 泛素连接酶作用。能够特异地识别底物，使之发生泛素化修饰，通过蛋白酶体进行降解或者参与其他的细胞内的生物学过程，泛素-蛋白酶体降解系统是调节细胞内蛋白平衡的一种重要方式。而 AD 疾病中 β-淀粉样蛋白、Tau 蛋白的沉积是其主要病理学特征，由此可见 parkin 与 Tau 蛋白的沉积密切相关。而本研究显示 parkin 干预 AD转基因果蝇模型 ninaE-GAL4/CyO; UAS-hTauR406W/TM3 后，与疾病模型组比较，ninaE-GAL4 / UAS-dpar-kin; UAS-hTauR406W/ + 果蝇复眼结构比较完整，复眼面积有所增大，纹路较清晰，且 ATP 值增高。

　　另外，parkin 的作用多样，如在各种应激中 par-kin 阻止了细胞的凋亡; parkin 被认为通过自噬调控着线粒体的功能; parkin 可以介导线粒体的分裂等。且过度磷酸化的 Tau 蛋白可以通过线粒体分裂蛋白 Drp1 在体内的错误定位而促进神经元的变性，线粒体的功能异常被认为与 AD 等相关的神经变性型疾病有关。有研究表明，Tau 蛋白的过度磷酸化可以导致果蝇和老鼠体内线粒体的延长，进而导致线粒体功能紊乱，以及细胞的死亡。本研究显示将 Drp1 敲除后，dparkin 对 AD 转基因果蝇模型的保护作用明显减弱。可见，上述研究 parkin对 AD 转基因果蝇模型具有的神经保护作用可能与线粒体分裂蛋白 Drp1 有关。而这种保护的确切机制还需进一步研究。