脂肪干细胞和生物支架应用于修复骨缺损的文献综述

　　0 引言 Introduction

　　因外伤、感染、肿瘤、年龄和激素水平等病理或生理性原因造成的牙槽骨吸收、缺损在临床中很常见，如何重建缺损牙槽骨以便于后续口腔治疗的顺利进行成为临床医生热切关注的问题。目前临床常用的修复方法包括：骨移植、上颌窦提升术、引导组织再生术、牵张成骨术等，但效果都不甚理想。

　　近年来，骨组织工程的兴起为修复缺损牙槽骨带来了新的生机。1995年Crane等系统的提出了骨组织工程的概念、研究方法、研究现状及发展前景，引起了广大学者的关注。骨组织工程是利用组织工程学的原理和方法研究细胞复合三维生物支架修复骨缺损的一门学科。目前寻找具有良好临床应用前景能用骨组织工程或细胞治疗的新的干细胞来源和适合于细胞的新型生物支架已成为大多学者的研究目标。近年来脂肪源性干细胞以其来源充足，取材容易，获取率高，患者痛苦小以及强大的扩增和分化潜能等独特的优势得到了广泛的关注。本文就骨组织工程的两大关键因素种子细胞和生物支架以及体内实验作一综述。

　　1、 资料和方法 Data and methods

　　1.1 资料来源

　　检索人相关内容：第一作者。

　　检索时间：1995年1月至2013年4月。

　　检索词：中文检索词：脂肪干细胞，分化、增殖和成骨生物支架，牙槽骨，骨组织工程。

　　英文检索词：Adipose ；stem； cells， Differentiation、proliferation； and； Osteogenesis， Biological； scaffold，alveolar； bone， bone； tissue； engineering。

　　检索数据库：维普、CNKI、Pubmed数据库。

　　检索文献量：检索文献数量总计163篇。

　　1.2 检索方法

　　纳入标准：关于脂肪干细胞、生物支架及动物实验的实验性研究成果报道。具有原创性，论点论据可靠，与本文题相关度高的文章。对同一领域的文献选择近期发表或权威杂志的文献。

　　排除标准：文献陈旧以及一些重复性研究。

　　1.3 质量评估。 初检得到163篇相关文献，阅读标题和摘要进行初筛，排除因研究目的与此文无关7篇，排除较陈旧的文献46篇，内容重复的文献39篇；其余做进一步分析阅读，查阅全文，判断与纳入标准一致的文章，最后选择40篇符合标准的文献。

　　2、 结果 Results

　　2.1 纳入文献基本情况。 纳入的40篇文献中，中文文献5篇，英文文献35篇。文献1是骨组织工程的提出，文献[2-7]主要涉及脂肪干细胞的来源、重要性及参与的血管工程骨实验，文献[8-20]探讨生物支架的种类及特性，文献[21-31]探讨生物支架对种子细胞的影响，文献[32-40]是论证骨髓基质干细胞复合生物支架用于动物实验的成果。

　　2.2 检索结果描述

　　2.2.1 脂肪干细胞的来源和应用价值

　　脂肪干细胞的来源：骨组织工程的种子细胞研究较早较多的是骨髓基质干细胞，但骨髓采集有潜在的局限性，骨髓中干细胞含量很少，不易获取，扩增能力有限，有创操作，对患者伤害大等。因此，很多学者致力于寻找一种新的种子细胞。在整形外科抽脂术普及的同时，有学者发现在脂肪组织中能以最小的伤害度获得大量干细胞，其可以成为一个干细胞源的替代。2001年，Zuk等从抽脂术获取的脂肪组织中分离出具有多向分化潜能的细胞，该细胞可向脂肪细胞、软骨细胞、肌源性细胞、骨源性细胞及血管内皮细胞等多种细胞分化，具有干细胞所特有的多向分化潜能及自我复制能力，因此，将其命名为脂肪源性干细胞，简称脂肪干细胞。这些细胞在活性诱导成骨因子的作用下，能够表达骨细胞的表型，并分泌胞外基质，提示了这些细胞可能具有骨髓基质干细胞相似的特征。

　　脂肪干细胞的应用价值：脂肪干细胞是一种很有应用前景的种子细胞，其优点有：来源广泛，脂肪组织在体内分布广泛，储量丰富，可根据细胞需要量通过常规抽脂术获得，不需体外长期培养扩增，避免了传代引起细胞生物学特性改变的风险。具有一定的免疫调节能力。有研究表明，脂肪干细胞与骨髓基质干细胞具有相似的免疫原性，在体外可抑制淋巴细胞增殖，调节淋巴细胞的反应能力。易采集，经济便捷，对患者心理影响小，患者易接受。

　　移植方式自体、异体均可，且结果安全有效。易于临床推广，且在体内无活性诱导因子刺激也可以成骨，这使它在未来骨组织工程修复骨缺损的应用中备受关注。

　　Zuk等在抽脂术获得的脂肪组织中提取脂肪干细胞，平均每300 mL脂肪组织可获得2×108-6×108个细胞，它是一群混合细胞，除大量的脂肪干细胞外，还有少量的非间充质干细胞，如前脂肪细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等。但经过传代非间充质干细胞逐渐消失，可得到纯化的脂肪干细胞。在细胞培养方面，其与研究较成熟的其他成体干细胞相比有特有的优势：脂肪干细胞易体外培养，置于37 ℃、体积分数5%CO2的孵箱中即可；营养需求低，在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中培养；体外扩增迅速、持久，体外倍增时间16-48 h即可传代，即使传代多次(第10代出现衰老细胞少于5%，第15代时低于15%)仍能表达干细胞表型，维持多向分化的潜能，由此可看出脂肪干细胞易获得，在体外较长时期内具有稳定的增殖能力和低衰老率；贴壁能力强，原代2 h即可贴壁，24 h几乎全部贴壁，传代后6 h几乎全部贴壁等。这充分表明脂肪干细胞具有强大的扩增能力，可通过传代培养纯化获得大量易定向分化的干细胞来满足实验和临床需要。

　　另外，利用脂肪干细胞的多向分化功能可形成血管化工程骨，Sahar等用血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白分别诱导的脂肪干细胞复合聚乳酸支架植入Lewis鼠颅骨缺陷模型，8周后检测，研究证实血管内皮生长因子诱导的脂肪干细胞虽不会增加骨形成，但可作为细胞源用于改善血管，潜在的提高成骨分化功能。血管内皮细胞可分泌骨形态发生蛋白，脂肪干细胞可分泌血管内皮生长因子，二者共培养可相互作用促进成骨，Zhao等将血管内皮细胞和脂肪干细胞共培养诱导6周，免疫荧光分析，碱性磷酸酶活性，骨钙素表达显著增高，暗示血管内皮细胞和脂肪干细胞的共培养系统可作为骨工程的细胞新来源。因此，脂肪干细胞是一个很有发展潜能的干细胞来源，具有非常重要的研究和应用价值。

　　2.2.2 生物支架的种类及特性。 不同的生物材料对细胞有不同的影响，选择合适的支架是骨组织工程的又一关键因素。理想的支架材料应具备以下性能： 良好的生物相容性，尽量不引起免疫排异反应，不致畸。

　　可降解，最终被自体再生组织替代，降解产物对细胞无毒害作用，降解速率应与组织再生速率相协调。良好的材料-细胞界面，利于细胞的黏附、增殖和生长。一定的可塑性，可根据缺损情况设计外形。三维结构，多孔性和高孔隙率，孔隙率最好达90%以上，既利于细胞的黏附和长入，又利于营养物质与代谢物的交换。满足生理需要的力学特性。具有良好的骨传导性和诱导性。较易制备，成本低，易消毒等。常用的骨组织工程的支架材料分为天然的和人工合成的，后者又可分为有机和无机的。

　　天然高分子材料：天然高分子材料包括：胶原、壳聚糖(chitosan，CS)、脱钙骨基质等。这类材料本身就具有相同或类似于细胞外基质的结构，具有良好的生物相容性和降解性，能促进细胞的黏附、增殖和分化。例如胶原是一种天然蛋白质，在体内为钙化组织提供必不可少的三维结构基础，诱导矿物质沉积。牛刚等利用山羊双侧下颌骨牵张成骨动物模型研究胶原海绵在下颌骨牵张成骨早期成骨中的作用，结果证明加入胶原海绵的实验侧牵张区新骨早期成骨效果明显好于同期的对照侧，说明胶原海绵具有良好地促进牵张区新骨早期形成和矿化的作用。另有研究发现，骨髓基质干细胞复合胶原海绵共培养，成骨诱导14 d检测，碱性磷酸酶染色强阳性,茜苏红染色细胞外钙盐沉积及钙结节,表明细胞向成骨细胞分化。口腔颌面部颞下颌关节盘基质中主要是Ⅰ型胶原，用Ⅰ型胶原做支架材料修复其损伤，可为关节盘生长和分化创造出更加接近天然生长的微环境，更利于组织修复。但其来源稀少，大量制备困难，机械性能差，加工性、重现性、降解速度可调性不理想，而且存在转染动物基因和产生免疫反应的风险。因此，难以单独作为骨组织工程的支架材料。

　　人工合成无机材料：人工合成无机材料包括羟基磷灰石和β磷酸三钙、生物活性玻璃等。这类材料具有良好的骨诱导性和传导性，人类骨组织中含有一些与其组成元素相同的成分如钙磷等，可促进骨组织新生。如β磷酸三钙不仅有可降解性，并且能通过释放钙磷离子促进组织的矿化。所以在口腔颌面骨，尤其是修复缺损牙槽骨人工合成无机材料的应用是一大热点。Wang等研究利用β磷酸三钙结合自体成骨细胞构建工程骨修复犬牙槽嵴模型，结果成骨细胞/β磷酸三钙组显著增强了新骨的形成与矿化，并保持了牙槽嵴的高度与厚度，效果可与自体髂骨移植组相媲美，说明β磷酸三钙作为骨组织工程支架材料的潜力。Kim等研究证实多孔TCP涂层Al2O3支架植入兔缺损模型比未涂层支架组在24周时显示出3倍的骨组织长入。钙基材料可刺激成骨细胞在体内外增殖或成骨，这类材料的使用成为一种有效的方法来提高工程化骨。但这类材料的缺点是脆性大、易折、易疲劳，降解速度可调性差，材料降解与骨新生速度不协调等。

　　人工合成高分子有机材料：人工合成高分子有机材料包括：聚乳酸(polylactic； acid，PLA)、聚羟基乙酸(polylglycolic； acid，PGA)及其共聚物聚乳酸-聚羟基乙酸(polylactic-co-glycolic，PLGA)等。这类材料易制作，结构多变，可塑性强可根据缺损设计外形，生物相容性良好等。Park等将脂肪干细胞复合可吸收的聚乳酸-聚羟基乙酸支架成骨诱导共培养4周，修补大鼠胫骨临界尺寸缺损模型，CT显示近完全愈合，RT-PCR分析成骨基因表达显著。Mahmoudifar等将脂肪干细胞接种于聚羟基乙酸网状支架共培养，2周后检测骨桥蛋白和骨钙素高表达。但这类材料的缺点有亲水性差，细胞吸附能力弱；降解产物会使pH值下降，引起无菌性炎症；机械强度差，对于承重部位缺损单独使用效果差，所以单独应用这类材料也不理想。

　　综上所述，单一类型的材料单独应用其成骨作用有限，不能达到很好的临床效果。为了增强其成骨作用，许多学者综合了各类材料的优缺点，将单一材料合成复合支架材料应用于骨组织工程领域 。Kim等在壳聚糖和壳聚糖/羟基磷灰石支架上接种人间充质干细胞，结果复合材料组可增强细胞的黏附与增殖，碱性磷酸酶活性更高，骨钙素显著增高。赵健等研究Bio-oss胶原支架复合细胞修复种植体周围骨缺损，效果良好。这都说明复合材料相对于单一材料具有优越性。活性因子有诱导成骨的作用，Deconde等将骨形态发生蛋白2浸染的仿生支架植入大鼠下颌骨缺损模型，治疗后2个月，CT分析成功诱导下颌骨缺损愈合。刘冰等在牙槽骨缺损处植入重组人骨形态发生蛋白2修饰的复合支架，诱导新骨形成以填充缺损，与对照组(未用人骨形态发生蛋白2修饰组)相比成骨效果显著。复合材料集合各类材料优点，在实验中取得了良好的效果，是一类很有发展前景的生物支架材料。目前对复合材料的研究正逐步引入纳米技术和基因转染技术等。

　　2.2.3 生物支架对种子细胞的影响。 引导细胞向三维方向生长有利于组织修复，然而细胞自由的生长迁移会形成一个二维细胞层，这不能满足组织工程的需要。生物支架具有三维结构，是细胞外基质的替代物，不仅起支撑作用，保持原组织形状，而且为细胞在缺损区的黏附、生长和分化提供了稳固的框架，为组织的修复活动提供适宜的微环境，有利于组织修复的进行。因此，生物支架对细胞生物学行为有很重要的影响。

　　黏附作用：生物支架对种子细胞的有利作用是组织工程发展的重要要求之一。快速、高效和空间上均匀的细胞黏附可以提高组织工程的临床潜力。支架对细胞黏附作用的影响是多方面的，主要是材料的表面性质，材料的亲水性、表面荷电性、表面修饰物、表面自由能等都将不同程度的影响细胞与材料的黏附。有研究发现用含带正电基团的氨基酸修饰材料表面，可提高材料表面的荷电浓度，增加黏附细胞数量和增强细胞黏附力。材料粗糙程度也影响细胞的黏附。Strauss等研究证实镍钛纳米表面涂层增加表面粗糙度，更有利于细胞的黏附。另外，支架的多孔结构及孔径大小对细胞的黏附也有一定的影响。

　　Marino等将人脂肪干细胞与多孔三维支架β磷酸三钙复合后共培养，结果证实细胞黏附性明显增强。

　　增殖作用：组织修复需在细胞增殖、生长的前提下才能完成。修复过程中，支架材料的降解成分溶于培养液中可带给细胞不同的生长微环境，引起细胞信号传导的变化而影响细胞的增殖。如钙磷生物陶瓷类材料溶解产生的钙磷离子对成骨细胞的增殖起着重要的作用。羟基磷灰石成分类似骨和牙齿，有良好的生物相容性，在细胞培养中，羟基磷灰石/壳聚糖膜比单纯壳聚糖膜可吸收更多的Ca2+，细胞更好的黏附、增殖和成骨分化，骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原蛋白高表达。Verma等将成骨细胞与壳聚糖/果胶酸/羟基磷灰石复合支架材料共培养，结果有效促进了成骨细胞的黏附和生长，增殖作用更明显。增加生物支架的孔径大小和孔隙率也有利于细胞的增殖和增强组织再生。Kim等用TCP涂层氧化铝后烧结生成表面多孔支架，空隙介于100-600 ?m(理想细胞增殖支架)，细胞增殖分化能力明显高于非涂层支架。另外，如血小板衍生生长因子、转化生长因子β1、碱性成纤维细胞因子等一些生长因子对细胞的增殖也有一定的影响。Xu等将不同浓度血小板衍生生长因子BB结合骨髓基质干细胞/β磷酸三钙修复鼠颅骨标准尺寸缺损，结果实验组比对照组(不含血小板衍生生长因子BB)细胞增殖能力明显增强，8周后计算机断层扫描和组织学分析新骨形成，且浓度高者更佳，说明血小板衍生生长因子可促进细胞增殖与成骨分化。

　　分化作用：一些生物支架材料具有与天然骨相似的化学成分，如羟基磷灰石、TCP等生物陶瓷类材料在培养过程中能释放钙磷等离子，可促进细胞的成骨分化。

　　Eyckmans等证明钙磷可激活相关分子信号通路，增强体内钙磷驱动、异位成骨的内在机制，将人骨膜衍生细胞接种于羟基磷灰石/胶原支架和脱钙支架植入裸鼠皮下异位成骨，细胞成骨分化发生在羟基磷灰石/胶原支架，基因动态表达也快于脱钙支架。Charles等将成骨细胞复合聚乳酸/CaP支架体外培养，观察细胞的成骨能力，结果证实支架对细胞的成骨分化能力影响显著。支架的表面活性基团，几何拓扑结构，基底模量等都是影响细胞分化的因素。Chen等以透明质酸、甲基胶原修饰聚已内酯(Polycaprolactone，PCL)三维支架表面，干细胞在支架上的成骨分化能力明显改善。细胞成骨分化也受许多激素、细胞因子及一些小分子的调控，如骨形态发生蛋白2、Wnts等对促进成骨分化有重要的作用。Zhang等将人牙周膜细胞接种于壳聚糖/胶原支架，复合编码人骨形态发生蛋白7的腺病毒载体后，植入下颌骨模型处，4周和8周检测，结果显示比对照组，未复合编码人骨形态发生蛋白7的腺病毒载体的支架）碱性磷酸酶活性、骨钙素、骨涎蛋白表达更高。因此，将一些成骨诱导因子整合到生物支架上对骨组织工程研究有很大的意义。

　　2.2.4 脂肪干细胞复合生物支架用于动物实验的研究

　　骨组织工程中，脂肪干细胞的体内成骨能力已被证实，而且脂肪干细胞复合生物支架构建工程骨的动物体内实验也一直被研究。Dragoo等将大鼠脂肪干细胞接种于聚乳酸-聚羟基乙酸支架上，植入裸鼠背部皮下共培养，成功生成组织工程骨，这是首次利用脂肪干细胞 体内培养成骨的实验报道。Haslauer等研究证实人脂肪干细胞在双组份纳米纤维支架(胶原蛋白-聚已内酯鞘涂层)比单组分支架(聚已内酯鞘涂层)上有更大的扩散、增殖，钙堆积量高于5倍，更有利于成骨，这是首次研究双组份纳米纤维支架对人脂肪干细胞的活力、增殖及成骨的影响。Tobita等在大鼠牙周组织缺损模型中加入脂肪干细胞和富血小板血浆的混合物，实验发现有牙槽骨和牙周膜韧带样结构的再生，未来可用于临床牙周疾病的治疗。LeviB等将新鲜未进行成骨诱导的脂肪干细胞的接种至聚乳酸-聚羟基乙酸支架植入鼠颅骨缺损处，结果有新骨形成，进一步肯定了脂肪干细胞在骨缺损修复中的应用潜能，实验提示不经体外成骨诱导的脂肪干细胞复合支架也可在体内成骨，原因可能是支架本身的骨诱导性或刺激体内产生诱导因子。目前对于较长期的动物实验也有研究，Cui等将脂肪干细胞接种于珊瑚网状支架植入缺损区, 进行了长达6个月的跟进观察，成功的修复了狗颅骨缺损模型，动物实验不再仅局限于小动物和短期试验。有学者将脂肪干细胞/β磷酸三钙植入有免疫缺陷的小鼠背部，电子扫描电镜检测，相对于对照组(单纯脂肪干细胞)细胞增殖能力增强，碱性磷酸酶活性更高，骨钙素表达更高，脂肪干细胞/β磷酸三钙加入重组人骨形态发生蛋白2效果更显著，这充分说明种子细胞、生物支架和细胞因子3个因素交互作用可为临床修复骨缺损提供一个更优化的微环境。Qing等将转染骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7基因的脂肪干细胞接种在β磷酸三钙支架后，植入SD大鼠缺损处，实验证实转染双基因组新骨形成更快，这为治疗骨缺损提供了一种新方法。Hao等利用腺病毒转染人骨形态发生蛋白2的脂肪干细胞复合纳米羟基磷灰石/重组人类胶原蛋白/聚乳酸支架体外培养7 d，植入兔桡骨缺损处，12周影像学和组织学分析，实验组骨重建，支架完全降解，提供一种新方法、新型复合材料在体内诱导可在相对较短的时间修复严重骨缺损。Fang等将脂肪干细胞接种于载杜仲醇提取物支架材料和羟基磷灰石材料，植入兔下颌骨缺损处，经培养、检测，均有成骨且载杜仲醇提取物的支架明显优于羟基磷灰石，证实杜仲醇提取物有成骨诱导作用及其复合材料应用于修颌骨缺损可行性。因此，脂肪干细胞复合生物支架修复骨缺损可做为骨组织工程重要基础工具，具有良好的发展空间。

　　3、 问题和展望 Problems and prospects

　　骨组织工程具有良好的发展前景，但利用脂肪干细胞与生物支架构建工程骨修复缺损牙槽骨还存在一定的问题，牙槽骨在口内承受复杂、较大的应力，生物力值不明确，人和动物体内微环境是否一致等。目前的研究大多数是体外实验及小动物实验，要将骨组织工程应用于临床牙槽骨再生，仍需大量的实验和临床前研究。

　　牙槽骨具有高度可塑性、吸收和新生的动态平衡动态等特性，这也是修复牙槽骨需要进一步研究的方向。另外，脂肪干细胞的管理、质量控制、污染，最适合脂肪干细胞支架材料的选择等问题也有待于解决。

　　随着骨组织工程的发展，汇聚细胞生物学、医学、材料学、工程学等多学科的最新研究成果，综合运用于牙槽骨缺损的修复，相信在不远的将来这些问题都可以解决，由基础实验向临床应用转变，最终实现真正意义上的牙槽骨再生，为口腔疾病的后续治疗提供最有利的条件，口腔医学的发展必定会发生巨大的变化。

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