羟基磷灰石和壳聚糖制备微米级微球支架

　　运用组织工程骨进行骨组织再生修复已成为当下研究的热点之一。而生物支架在骨缺损的修复过程中起到关键性作用，被誉为组织工程的“基石”.复合类仿生支架 （ 有机物与无机物结合） 可以模拟天然成熟骨组织的结构，在促进干细胞增殖、骨向分化 等 方 面 具 有 显 着 优 势[1]. 羟 基 磷 灰 石（ hydroxyapatite,HAp） 作为人体骨骼和牙齿的主要组成，生物相容性良好，并有足够的机械强度可承受体内压力； 纳米级 HAp 利于成骨细胞黏附，具有骨诱导性，常被作为仿生支架的制备原料[2].壳聚糖（ chitosan,CS） 作为一种天然的再生来源聚合物，生物性能佳，易于化学改性并对体内大分子有高度亲和性，是一类颇有前景的组织工程支架材料[3].该研究采用微流体技术将纳米 HAp 和 CS 制备成微米级微球支架，并通过一系列细胞学实验评估其作为组织工程支架的生物学作用。

　　1 材料与方法

　　1. 1 材料及设备

　　1. 1. 1 实验动物与试剂 SPF 级雄性 4 周龄 SD 大鼠 20 只，由安徽医科大学实验动物中心提供。微球制备相关试剂 （ 国药集团化学试剂有限公司） ,高糖型 DMEM （ 美国 Invitrogen 公司） ,胎牛血清 （ FBS）（ 中国四季青公司） ,异硫氰酸标记的鬼笔环肽（ FITC-Phalloidin） 、DAPI （ 美国 Sigma 公司） ,琼脂糖（ 美国 Solarbio 公司） .

　　1. 1. 2 主要仪器 微量进样泵 （ 中国兰格恒流泵有限公司） ,pH 计（ PHS-3B,中国上海虹益公司） ,Countstar 自动细胞计数仪 （ IC 1000,中国上海睿钰生物科技有限公司） ,荧光倒置显微镜 （ DMI3000B,德国 Leica 公司） ,场发射扫描电子显微镜 （ JSM-6700F,日本 JEOL 电子公司） ,共聚焦扫描式显微镜（ SP5-DMI6000-DIC,德国 Leica 公司） .

　　1. 2 方法

　　1. 2. 1 HAp 纳米颗粒合成 5 mmol 尿素溶于 20ml 乙醇与水 （ 3 ∶ 1） 混合溶液中，加入 CaCl2（ 0. 1mol / L,8. 35 ml） 与 NaH2PO4（ 0. 1 mol/L,5 ml） ,pH值调至 11. 9.搅拌 30 min,置于 80 ℃ 烘箱 24 h.产物洗涤冻干备用。

　　1. 2. 2 复合微球制备及显微镜下形态学观察 CS及 HAp 各 40 mg 加入 19. 6 ml 蒸馏水中，超声破碎20 min,所得 HAp-CS 混合溶液作为内相，环己烷溶液 （ 含 3% 司班 80） 作为挤出相。利用微量进样泵控制两相挤出速度，外向 1 ml/min,内相 0. 05 ml/min,进行微球制备，NaOH 乙醇溶液 （ 0. 4 mol / L）进行收集固化，所得 HAp-CS 复合微球蒸馏水反复清洗，显微镜下观察微球形态。

　　1. 2. 4 细胞黏附率及增殖率 微球高温高压灭菌了，与 P2 代骨髓间充质干细胞（ bone marrow mesen-chymal stem cells,BMSCs） 体外共培养。黏附率： 细胞与微球复合之比为 50 ∶ 1 （ 细胞初始浓度为 C0=5 × 104/ ml） .设置 3 个复管，置于培养摇床上，先动态培养 5 min,后静置30 min,交替进行6 h.1、2、3、4、5、6 h 等 6 个时间点，分别吸取 1 ml 细胞微球混合溶液，静置 1 min,上清液中的游离细胞计数为Ct,黏附率为（ C0- Ct） /C0× 100% .取 3 个复管平均值。增殖率： 前 6 h 动静态交替培养操作同上，设置 3 个复管。1、3、6、9 d 时，取 1 ml 细胞微球混悬液，静置后吸除上清液，PBS 清洗 3 次，胰酶消化，定容至 1 ml,细胞和微球均计数，细胞浓度为 C,每毫升微球数为 N,二者之比为 C/N,该数值随时间的增长体现了细胞在微球上的增殖。3 个复管所得值求平均数。