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羟基磷灰石和壳聚糖制备微米级微球支架

来源:学术堂 作者:周老师
发布于:2015-11-11 共3518字
摘要

  运用组织工程骨进行骨组织再生修复已成为当下研究的热点之一。而生物支架在骨缺损的修复过程中起到关键性作用,被誉为组织工程的“基石”.复合类仿生支架 ( 有机物与无机物结合) 可以模拟天然成熟骨组织的结构,在促进干细胞增殖、骨向分化 等 方 面 具 有 显 着 优 势[1]. 羟 基 磷 灰 石( hydroxyapatite,HAp) 作为人体骨骼和牙齿的主要组成,生物相容性良好,并有足够的机械强度可承受体内压力; 纳米级 HAp 利于成骨细胞黏附,具有骨诱导性,常被作为仿生支架的制备原料[2].壳聚糖( chitosan,CS) 作为一种天然的再生来源聚合物,生物性能佳,易于化学改性并对体内大分子有高度亲和性,是一类颇有前景的组织工程支架材料[3].该研究采用微流体技术将纳米 HAp 和 CS 制备成微米级微球支架,并通过一系列细胞学实验评估其作为组织工程支架的生物学作用。

  1 材料与方法

  1. 1 材料及设备

  1. 1. 1 实验动物与试剂 SPF 级雄性 4 周龄 SD 大鼠 20 只,由安徽医科大学实验动物中心提供。微球制备相关试剂 ( 国药集团化学试剂有限公司) ,高糖型 DMEM ( 美国 Invitrogen 公司) ,胎牛血清 ( FBS)( 中国四季青公司) ,异硫氰酸标记的鬼笔环肽( FITC-Phalloidin) 、DAPI ( 美国 Sigma 公司) ,琼脂糖( 美国 Solarbio 公司) .

  1. 1. 2 主要仪器 微量进样泵 ( 中国兰格恒流泵有限公司) ,pH 计( PHS-3B,中国上海虹益公司) ,Countstar 自动细胞计数仪 ( IC 1000,中国上海睿钰生物科技有限公司) ,荧光倒置显微镜 ( DMI3000B,德国 Leica 公司) ,场发射扫描电子显微镜 ( JSM-6700F,日本 JEOL 电子公司) ,共聚焦扫描式显微镜( SP5-DMI6000-DIC,德国 Leica 公司) .

  1. 2 方法

  1. 2. 1 HAp 纳米颗粒合成 5 mmol 尿素溶于 20ml 乙醇与水 ( 3 ∶ 1) 混合溶液中,加入 CaCl2( 0. 1mol / L,8. 35 ml) 与 NaH2PO4( 0. 1 mol/L,5 ml) ,pH值调至 11. 9.搅拌 30 min,置于 80 ℃ 烘箱 24 h.产物洗涤冻干备用。

  1. 2. 2 复合微球制备及显微镜下形态学观察 CS及 HAp 各 40 mg 加入 19. 6 ml 蒸馏水中,超声破碎20 min,所得 HAp-CS 混合溶液作为内相,环己烷溶液 ( 含 3% 司班 80) 作为挤出相。利用微量进样泵控制两相挤出速度,外向 1 ml/min,内相 0. 05 ml/min,进行微球制备,NaOH 乙醇溶液 ( 0. 4 mol / L)进行收集固化,所得 HAp-CS 复合微球蒸馏水反复清洗,显微镜下观察微球形态。

  1. 2. 4 细胞黏附率及增殖率 微球高温高压灭菌了,与 P2 代骨髓间充质干细胞( bone marrow mesen-chymal stem cells,BMSCs) 体外共培养。黏附率: 细胞与微球复合之比为 50 ∶ 1 ( 细胞初始浓度为 C0=5 × 104/ ml) .设置 3 个复管,置于培养摇床上,先动态培养 5 min,后静置30 min,交替进行6 h.1、2、3、4、5、6 h 等 6 个时间点,分别吸取 1 ml 细胞微球混合溶液,静置 1 min,上清液中的游离细胞计数为Ct,黏附率为( C0- Ct) /C0× 100% .取 3 个复管平均值。增殖率: 前 6 h 动静态交替培养操作同上,设置 3 个复管。1、3、6、9 d 时,取 1 ml 细胞微球混悬液,静置后吸除上清液,PBS 清洗 3 次,胰酶消化,定容至 1 ml,细胞和微球均计数,细胞浓度为 C,每毫升微球数为 N,二者之比为 C/N,该数值随时间的增长体现了细胞在微球上的增殖。3 个复管所得值求平均数。

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