纯钛不同的表面处理后与成纤维细胞的结合情况分析

　　种植体修复已经成为牙列缺失、缺损的常用修复方法。植入患者口内的种植体想要获得良好的稳定性，长期行使功能，不仅需要其与骨组织紧密整合，还要与软组织形成牢固的生物学封闭屏障。Puckett et al[1]通过实验证明采用不同方法处理种植体表面会影响成纤维细胞的黏附、增殖。然而，目前国内的研究基本集中在钛种植体与骨组织的结合，与软组织结合的研究较少。该实验通过对纯钛进行不同的表面处理后进行成纤维细胞与材料的共培养，研究细胞在不同处理表面的生长情况，从而探讨更有利于与软组织结合的种植体表面形态。

　　1 材料与方法

　　1. 1 实验材料和设备 纯钛棒（ TA2,宝鸡和信泰金属有限公司）；L-929 小鼠成纤维细胞（南京凯基生物科技发展有限公司）；β-甘油磷酸二钠盐五水（国药集团化学试剂有限公司）；乙酸钙（南京凯基生物科技发展有限公司）；优质胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；DMEM（美国 Gibco 公司）；DMSO（美国 Sigma 公司）；微弧氧化相关设备（西安理工大学自制）；S-3400NⅡ扫描电子显微镜（日本日立公司）；超净工作台（SW-CJ-1FD,苏州净化设备有限公司）；CO2培养箱（日本 SANYO 公司）；生物倒置显微镜（日本 Olympus 公司）；台式低速离心机（中国上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂）；酶标仪（美国 BioTek 公司）。

　　1. 2 方法

　　1. 2. 1 纯钛片的制备及分组 将纯钛棒线性切割成直径为 10 mm,厚为 1 mm 的圆形钛片试件，在流水下用耐水砂纸逐级打磨至 1200#后，打磨膏抛光，依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗 30 min后干燥备用。根据不同处理方法将纯钛片随机分为光滑组、双重酸蚀喷砂组（先在0. 5 Mpa 气压下将直径为 200 μm 的 Al2O3颗粒对钛片表面进行均匀的垂直喷射，距离钛片 1 cm;喷砂后用去离子水超声清洗后浸入 66% HNO3与 40%HF 的混合液溶液中10 min,取出后去离子水清洗） 、氢氟酸酸蚀喷砂组（喷砂方法与双重酸蚀喷砂组相同，试件喷砂后去离子水超声清洗后浸入质量百分比为 0. 5% 的 HF溶液中 10 min,取出后去离子水清洗）、微弧氧化组（以纯钛为阳极，不锈钢锅为阴极，以 0. 04 mol/L β-甘油磷酸二钠盐五水和 0. 2 mol/L 乙酸钙的去离子水溶液为电解液，采用脉冲直流电源进行微弧氧化处理。所有试件在制备完成后经过高温高压消毒备用。处理参数为：电压 300 V,频率 500 Hz,占空比12%,处理时间为3 min.处理好后的试件立刻用去离子水冲洗、吹干）。

　　1. 2. 2 试件表面形态观察 将不同处理表面的钛片置于扫描电子显微镜下观察表面形态。

　　1. 3 成纤维细胞在不同处理表面生长情况1. 3. 1 成纤维细胞在不同试件表面的黏附 将存有 L-929 小鼠成纤维细胞的冻存管从液氮罐中取出，立即放入 37 ℃恒温水浴箱中，快速晃动冻存管1 ~ 2 min 后，取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液，加入到含培养液的离心管中并以 1 000 r/min 离心 5min 后弃上清液，调整细胞密度，接种于培养瓶中培养。成纤维细胞复苏后按 1 ∶ 3 的比例进行传代，选取快速生长期的第 4 代细胞，0. 25% 胰蛋白酶消化细胞系后制成 1. 0 ×105个/ml 浓度的单细胞悬液。

　　从 4 组中各取 5 片试件分别置于 24 孔培养板内，接种单细胞悬液，每孔 200μl;加入 DMEM 培养液（含10% 胎牛血清）2 ml,37 ℃ 、95% 湿度、5% CO2条件下分别培养 1、2、4 h 停止；PBS 轻轻漂洗数次，然后每孔加入 200 μl MTT（5 mg/ml）和800 μl 的 DMEM培养液置于 37 ℃条件下孵育 4 h 后，弃掉孔内上清液；加入 1 ml 的 DMSO 振荡 10 min,取 24 孔培养板内液体按原顺序转移至 96 孔培养板内，酶标仪在490 nm 光波长处测其光吸收值。计算各组吸光度均值，进行统计学分析，以 x珋 ± s 表示。

　　1. 3. 2 成纤维细胞在不同试件表面的增殖效果每组分别取 5 个试件分别置于 24 孔培养板内，取第4 代成纤维细胞，制成 2. 0 × 105个/ml 浓度的单细胞悬液，接种于试件表面，每孔 200 μl,加入 DMEM培养液（含 10% 胎牛血清）2 ml,37 ℃、95% 湿度、5% CO2条件下分别培养 1、3、5 d 停止。用 MTT 法检测细胞吸光度值。具体方法同 1. 3. 1.

　　1. 3. 3 成纤维细胞在不同试件表面的铺展 从 4组中各取 3 片试件分别置于 24 孔培养板内，取第 4代成纤维细胞，制成 4. 0 × 105个/ml 浓度的单细胞悬液，接种于试件表面，每孔 200 μl;加入 DMEM 培养液（含 10%胎牛血清）2 ml ,37 ℃、95% 湿度、5%CO2条件下培养 24 h 后取出。扫描电子显微镜观察各组试件表面细胞的铺展形态。

　　1. 4 统计学处理 使用 SPSS 20. 0 软件对数据进行单因素方差分析，SNK-q 检验比较组间差异。

　　2 结果

　　2. 1 扫描电子显微镜下观察各组表面形态 光滑组试件表面无明显凹陷；双重酸蚀喷砂组试件表面形成不规则的微孔结构，试件表面可见 Al2O3颗粒，颗粒形态不规则；氢氟酸酸蚀喷砂组表面形成不规则浅凹坑，少量 Al2O3颗粒嵌于表面之中，凹坑的边缘较锐利，坑壁不规则；微弧氧化组经微弧氧化处理后，表面形成多孔样结构，形成的孔隙孔径较均匀，向内凹陷，四周隆起，类似于“火山口”状。见图 1.

　　2. 2 MTT 法检测细胞的黏附结果 细胞在培养 1、2、4 h 各时间点，经过表面处理的粗糙表面的吸光度大于光滑表面，差异均有统计学意义（P <0. 05）。粗糙表面的吸光度氢氟酸酸蚀喷砂组 < 双重酸蚀喷砂组 < 微弧氧化组，差异均有统计学意义（P < 0. 05）。

　　2. 3 MTT 法检测细胞的增殖结果 细胞在培养

　　1、3、5 d 各时间点，经过表面处理的粗糙表面的吸光度大于光滑表面，微弧氧化组的吸光度最高，差异均有统计学意义（P <0. 05）。在 1、3 d 时间点吸光度氢氟酸酸蚀喷砂组 < 双重酸蚀喷砂组，差异有统计学意义（P < 0. 05）；在 5 d 时，双重酸蚀喷砂组、氢氟酸酸蚀喷砂组的吸光度相似，差异无统计学意义。见图 3.

　　2. 4 各组试件表面成纤维细胞生长形态 光滑组试件表面成纤维细胞呈圆形或椭圆形，偶可见细胞伸出细小伪足；双重酸蚀喷砂组试件表面成纤维细胞呈圆形或椭圆形，胞体丰满，伸展良好，有较多伪足伸出，试件表面可见细胞外基质；氢氟酸酸蚀喷砂组试件表面细胞形态与双重酸蚀喷砂组相类似；微弧氧化组试件表面可见成纤维细胞胞体丰满，在试件表面良好铺展，细胞之间伸出大量伪足并相互融合，细胞伸出的伪足伸入试件表面的孔隙之中，“锚定”在试件表面，与试件紧密附着，试件表面存在大量细胞外基质。见图 4.

　　3 讨论

　　随着技术的不断改进，目前纯钛种植体修复 10年的成功率已达到 98. 5%[2].人们将研究的重点主要集中于如何提高纯钛种植体与骨组织之间的结合[3],忽略了纯钛种植体与软组织结合的重要性。研究[4]表明种植体与软组织结合形成良好的生物学封闭可以保证种植体获得长久的稳定性。如何促进种植体与软组织之间的结合，进一步提高种植修复的成功率已成为目前研究的热点之一。本实验通过比较纯钛表面不同处理方法对成纤维细胞生长的影响，探讨更利于软组织结合的表面处理方法。

　　本实验中表面处理采用喷砂酸蚀法和微弧氧化法，其中喷砂酸蚀表面已经成为使用最广泛的种植体表面。经过喷砂酸蚀处理过的种植体表面可有效促进成骨细胞的黏附与增殖[5].经过微弧氧化处理不仅可以获得均匀的氧化膜，而且形成的膜有更好的耐腐蚀性，与试件表面结合更紧密，不易脱落[6].研究[7]表明微弧氧化有良好地生物相容性，可以与骨组织形成良好地结合。

　　本实验通过 MTT 法检测显示微弧氧化较喷砂酸蚀更能促进成纤维细胞早期在试件表面黏附、增殖，从而利于软组织与种植体的结合。扫描电镜下观察，发现成纤维细胞在微弧氧化表面拥有更好的铺展形态。推测可能是由于一些不可控因素[8]影响了喷砂酸蚀表面与细胞的结合。

　　微弧氧化技术不仅能够通过调整工艺参数、电解液的成分制备出具备不同特性的涂层，而且微弧氧化涂层自身所具备的多孔样结构可以为其他生物活性因子提供附着空间，使微弧氧化表面具备新的功能。已有学者[9]将抗菌剂卤代呋喃酮化合物嵌于微弧氧化的微孔中来预防种植体可能出现的相关感染，促进种植体与软组织的结合。此外微弧氧化技术所需操作设备成本较低、操作方法简单、制备效率高，可以同时制备多个试件，适合商业化大规模生产。这使经微弧氧化处理的种植体应用于临床成为了可能。当然负荷、冠修复、感染及全身状况等因素都会影响种植体与软组织形成良好结合，只有临床医师综合考虑各方面因素才能有效提高使种植体的成功率及长期使用率。

　　参考文献

　　[1]Puckett S D,Lee P P,Ciombor D M,et al. Nanotextured titaniumsurfaces for enhancing skin growth on transcutaneous osseointegrat-ed devices[J]. Acta Biomater,2010,6（6）：2352 -62.

　　[2]Mangano F G,Shibli J A,Sammons R L,et al. Short（8-mm）loc-king-taper implants supporting single crowns in posterior region:aprospective clinical study with 1-to 10-years of follow-up[J]. ClinOral Implants Res,2014,25（8）：933 - 40.

　　[3] 孙 敏，唐旭炎，吴占傲，等。 钛酸钙涂覆的纯钛片对成骨细胞生长的影响[J]. 安徽医科大学学报，2013,48（11）：1324 -05.

　　[4]Inubushi T,Tanaka E,Rego E B,et al. Effects of ultrasound on theproliferation and differentiation of cementoblast lineage cells[J]. JPeriodontal,2008,79（10）：1984 - 90.

　　[5] 贾 彦，邓嘉胤。 钛种植体表面改性的研究现状及应用进展[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2009,13（12） :2321 - 4.

　　[6] 马 臣，王颖慧，曲立杰，等。 钛合金微弧氧化技术的研究现状及展望[J]. 中国陶瓷工业，2007,14 （1）：46 -9.

　　[7]Wu J,Liu Z M,Zhao X H,et al. Improved biological performanceof microarc-oxidized low-modulus Ti-24Nb-4Zr-7. 9Sn alloy[J]. JBiomed Mater Res B Appl Biomater,2010,92（2）：298 -306.

　　[8] Martin D C,O'Ryan F S,Indresano A T,et al. Characteristics ofimplant failures in patients with a history of oral bisphosphonatetherapy[J]. J Oral Maxillofac Surg,2010,68（3）：508 - 14.

　　[9] Cheng Y,Wu J,Gao B,et al. Fabrication and in vitro release be-havior of a novel antibacterial coating containing halogenated fura-none-loaded poly （ L-lactic acid ） nanoparticles on microarc-oxi-dized titanium[J]. Inter J Nanomed,2012（7）：5641 -52.