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维生素D结合蛋白与糖尿病肾病的关系探究

来源:学术堂 作者:姚老师
发布于:2015-12-21 共4363字
摘要

  维生素D结合蛋白(vitamin Dbinding protein,VDBP)属结合蛋白清蛋白家族,主要由肝脏合成,由肾小球滤过,可被近端肾小管上皮细胞重吸收,有文献报道肾脏也分泌少量的VDBP[1].近年研究者们发现VDBP可转化为一种强效的巨噬细胞活化因子(MAF),从而直接作用于内皮细胞[2].应用免疫荧光法检测可见,许多细胞表面都有VDBP结合[3].Mirkovic'等[4]的研究第一次证实了尿VDBP是独立于蛋白尿的一种肾小管间质损害生物标志物,并且出现于炎性反应及肾小管间质纤维化的早期。糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)作为2型糖尿病(T2DM)的重要并发症之一,一直是研究的热点。除常见致病机制外,有研究表明慢性炎性反应在DN的发生发展中也起到重要作用[5],而巨噬细胞是介导肾脏炎性反应的关键细胞。Chow等[6]研究表明,巨噬细胞参与了DN的发病及肾间质纤维化的过程。目前已知VDBP参与T2DM的发生及进展[7-11],且有文献报道尿VDBP水平与DN程度成正比[12].但尚罕见相关研究探讨VDBP在DN各期患者中的表达水平及影响因素。故本研究采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测T2DM患者血、尿VDBP水平并分析其相关影响因素,以明确VDBP与DN的关系,为DN的诊断及治疗提供新的依据。

  1对象与方法

  1.1研究对象
  
  选取2013年8月-2014年2月在大连医科大学附属二院住院的T2DM患者66例。纳入标准:均符合1999年WHO糖尿病诊断标准[13],空腹血糖(FPG)≥7.0mmol/L,或糖负荷后2h血糖≥11.1mmol/L.排除标准:(1)合并尿路感染及其他部位感染者;(2)伴有肿瘤、心功能衰竭、T2DM急性并发症(如糖尿病酮症酸中毒)者;(3)近期应用肾毒性药物或摄入高蛋白食物者;(4)妊娠、哺乳期及服用避孕药物的女性。根据美国糖尿病协会(AmericanDiabetesAssociation,ADA)2007年指南推荐的尿微量清蛋白与尿肌酐比值(UACR),将患者分为3个亚组:正常清蛋白尿组(UACR<30mg/g)、微量清蛋白尿组(UACR30~300mg/g)和临床清蛋白尿组(UACR>300mg/g)[14].同时选取该院门诊的健康体检者20例为健康对照组。纳入标准:均接受口服75g葡萄糖耐量试验(OGTT)证实为糖耐量正常。排除标准:(1)心脏病、高血压、高脂血症、肝肾疾病者;(2)有内分泌及代谢性疾病病史者;(3)近期无高蛋白食物摄入史;(4)妊娠、哺乳期及服用避孕药物的女性。本研究通过该院伦理委员会的审查,受试者均签署知情同意书。

  1.2方法
  
  (1)生化指标:受试者清晨空腹(禁食12h、禁饮8h)抽取静脉血5ml,1h内离心分离上清液送至该院检验中心测定FPG、糖化血红蛋白(HbA1c)、血肌酐(SCr)、血尿素(UREA)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血清蛋白(ALB);留取晨清洁中段尿20ml测定尿微量清蛋白以及尿肌酐。其余血样及尿样1h内离心,取上清液冻存-40.0℃冰箱,3个月内测定VDBP(ELISA法,中国优尔生公司)。(2)体质指数(bodymassindex,BMI):固定专人采用同一测量工具测量身高、体质量,并计算BMI.(3)估算肾小球滤过率(eGFR):根据简化MDRD公式计算,eGFR〔ml·min-1·(1.73m2)-1〕=186.3×〔SCr(g/L)〕-1.154×〔年龄(岁)〕-0.203×0.742(女性)。

  1.3统计学方法
  
  采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,其中两两比较采用q检验;相关分析采用Pearson相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

  2结果

  2.14组一般资料比较健康对照组男10例,女10例;正常清蛋白尿组男12例,女10例;微量清蛋白尿组男11例,女11例;临床清蛋白尿组男10例,女12例,4组间差异无统计学意义(χ2=0.36,P=0.94)。4组年龄、TC、BMI间差异无统计学意义(P>0.05);FPG、HbA1c、SCr、UREA、TG、HDL-C、LDL-C、ALB间差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。

  2.24组血VDBP水平比较健康对照组及正常、微量、临床清蛋白尿组血VDBP水平分别为:(44.83±15.65)、(312.25±29.57)、(330.92±49.28)、(338.30±50.05)mg/L,4组间差异有统计学意义(F=409.42,P<0.01);其中正常、微量、临床清蛋白尿组与健康对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);而正常、微量及临床清蛋白尿3组比较,差异无统计学意义(P>0.05,见图1)。

  2.34组尿VDBP水平比较健康对照组及正常、微量、临床清蛋白尿组尿VDBP水平分别为:(5.26±1.34)、(8.93±3.17)、(15.19±3.38)、(21.48±7.00)mg/L,4组间差异有统计学意义(F=58.66,P<0.01);其中两两组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05,见图2)。因尿VDBP检测采用晨尿点标本,无24h尿标本检测准确,故依据UACR法,用尿肌酐对尿VDBP值进行校正(尿VDBP/Cr)。健康对照组与正常、微量、临床清蛋白尿组尿VDBP/Cr水平分别为:(4.25±1.89)、(10.76±7.02)、(23.01±11.39)、(41.58±17.10)mg/g,4组间差异有统计学意义(F=47.38,P<0.01);其中两两组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05,见图3)。

  2.4T2DM患者尿VDBP水平与eGFR的相关性分析Pearson相关分析显示,患者尿VDBP水平与eGFR呈负相关(r=-0.413,P=0.015,见图4)。

  2.5T2DM患者血、尿VDBP水平与其他一般指标的相关性分析患者血VDBP水平为(301.52±20.26)mg/L,与FBG、HbA1c、UREA、SCr、TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALB均无相关性(P>0.05)。患者尿VDBP水平为(16.81±3.64)mg/L,与FBG、HbA1c、TG、TC、HDL-C、LDL-C均无相关性(P>0.05);而与SCr、UREA呈正相关,与ALB呈负相关(P<0.05,见表2)。

  3讨论

  DN是T2DM的主要并发症之一,因其起病隐匿,早期就诊率低,后期迅速进展为终末期肾脏病(ESRD),而严重危害人类健康。因此,DN的早期发现、早期干预至关重要。DN的发病机制比较复杂,其中炎性反应在DN发生发展过程中起着重要作用[15-18].

  在DN的病理改变中,巨噬细胞是介导肾脏炎性反应的关键细胞。Chow等[6]的研究表明,巨噬细胞参与了DN的发病及肾间质纤维化的过程。持续的高血糖状态、细胞趋化因子的生成、肾小球免疫复合物的沉积、肌成纤维细胞的数量以及IV型胶原沉积的程度与巨噬细胞的聚集和活化具有明显的正相关性。肾间质纤维化是各种慢性肾脏病的共同转归,而巨噬细胞是其发生和发展过程中的重要细胞基础。通过对人类T2DM患者的肾脏病理表现进行对比可见,肾小球硬化的程度与巨噬细胞的聚集程度密切相关,目前已证实,巨噬细胞参与DN发生与发展的机制是通过氧化应激实现的[19].

  VDBP是一种组特异性成分、一种糖基化的α-球蛋白,属结合蛋白清蛋白家族,分子量为58kDa,主要由肝脏合成,由肾小球滤过,并可经受体介导被近端肾小管上皮细胞重吸收,有文献报道肾脏也分泌少量的VDBP[1].VDBP的主要生物学功能是结合并转运维生素D(VitD)及其代谢产物,但除了结合VitD及其衍生物外,VDBP还有其他生物学功能。近年研究发现,在一些酶(包括T淋巴细胞的唾液酸酶和B淋巴细胞的β-半乳糖苷酶)的脱糖基化作用下,VDBP可转化为一种强效的巨噬细胞活化因子(MAF),直接作用于内皮细胞,抑制血管生成,同时刺激巨噬细胞促使其攻击异常生长的内皮细胞[2].VDBP不仅可以通过使补体C5a这种趋化因子免于被蛋白酶水解,延长其寿命,还可结合于粒细胞表面,明显增强其对巨噬细胞等炎性细胞的趋化作用[20].应用免疫荧光法检测可见,许多细胞(如中性粒细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、胎盘滋养层细胞等)表面都有VDBP结合。Mirkovic'等[4]研究第一次证实了尿VDBP是独立于蛋白尿的一种肾小管间质损害生物标志物,尿VDBP与肾小管炎性损伤标志物肾损伤分子-1(KIM-1)、β2微球蛋白(β2-MG)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys-C)、1-甲基环丙烯(MCP-1)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)相关联,并伴随肾小管间质损伤程度的加重而升高,出现于炎性反应及肾小管间质纤维化的早期,甚至早于肾间质纤维化的已知标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。近年来研究发现,VDBP可通过介导炎性反应调节与糖尿病有关的细胞因子[7-11].有文献报道尿VDBP水平与DN程度成正比[12].

  目前国内外尚罕见关于VDBP在DN各期患者中表达水平及影响因素的研究。本研究通过检测T2DM患者血、尿VDBP水平,发现:(1)T2DM各亚组患者血VDBP水平均明显高于健康对照组,而这3个亚组间血VDBP水平并无差异。患者血VDBP水平与FPG、UREA、SCr、ALB等一般指标均无相关性。T2DM患者血VDBP水平的特异性升高,不除外炎性反应等因素参与,具体机制需进一步研究证实,但这种升高的水平与DN的进展无相关性,不能通过血VDBP水平对DN进行分期,故本研究亦未进行血VDBP水平与eGFR的相关性分析。(2)T2DM各亚组患者尿VDBP(或尿VDBP/Cr)水平均明显高于较健康对照组,且伴随DN的进程,3个亚组间尿VDBP(或尿VDBP/Cr)水平亦逐渐升高,说明尿VDBP水平可应用于DN的诊断及分期。(3)通过尿VDBP与其他一般指标的相关性分析,发现患者尿VDBP水平与UREA、SCr呈正相关,而与eGFR呈负相关,这与既往文献报道一致[4].尿VDBP可经肾小球排出、肾小管重吸收,根据Mirkovic'等[4]的研究得知,由于肾间质纤维化程度加重使得尿VDBP重吸收减少,故尿VDBP水平伴随肾功能损害的加重而增加,本研究结果证实尿VDBP水平亦同样反映DN肾功能损害的进展。(4)通过尿VDBP与其他一般指标的相关性分析,还发现患者尿VDBP水平与ALB呈负相关,有文献报道应用免疫组化研究发现肾脏存在VDBP的基因表达[1],故患者尿VDBP的增多,除肾小管重吸收减少的因素之外,是否还存在肾脏分泌一部分VDBP的可能,可以通过进一步动物试验证实。(5)伴随DN的进展,尿清蛋白排泄的增多导致ALB的逐渐减少。结合本研究血、尿VDBP水平的综合分析,发现伴随DN的进展,尿VDBP排出明显增多,但血VDBP水平在DN各期中无明显差异,并明显高于健康对照组。这说明VDBP在T2DM及DN患者可能存在特异性升高,结合前文已知VDBP的免疫介导功能及趋化作用,可以推测VDBP可能通过巨噬细胞浸润途径参与T2DM及DN的发病及病情进展,可以进一步通过动物实验进行验证。

  健康对照组及正常、微量、临床清蛋白尿组一般指标比较结果显示:(1)临床清蛋白尿组UREA、SCr水平明显高于其他3组。这与临床清蛋白尿期(即DNIV期)会出现GFR下降的理论一致。(2)临床清蛋白尿组TG水平高于健康对照组及正常清蛋白尿组,HDL-C低于健康对照组,LDL-C高于健康对照组;正常、微量、临床清蛋白尿组ALB水平均明显低于健康对照组,且临床清蛋白尿组ALB水平也低于微量、正常清蛋白尿组。以上结果符合DN后期会出现大量蛋白尿、低蛋白血症,导致肝脏代偿性合成蛋白增多从而出现脂代谢紊乱的理论。

  本研究由于样本量较少,且ELISA法本身存在一定化验误差,关于VDBP与DN致病机制方面的关系还需进一步研究证实。T2DM患者血、尿VDBP水平均有明显升高。但本研究通过检测T2DM患者血及尿VDBP水平并分析其相关影响因素,发现伴随DN进展,尿VDBP水平逐渐增高,对评估DN的病情有一定的价值,其有可能成为DN新的早期诊断标志物,VDBP可能参与DN的病理生理过程,为DN的研究及治疗开拓了新的方向。

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