维生素D结合蛋白与糖尿病肾病的关系探究

　　维生素D结合蛋白（vitamin Dbinding protein,VDBP）属结合蛋白清蛋白家族，主要由肝脏合成，由肾小球滤过，可被近端肾小管上皮细胞重吸收，有文献报道肾脏也分泌少量的VDBP[1].近年研究者们发现VDBP可转化为一种强效的巨噬细胞活化因子（MAF），从而直接作用于内皮细胞[2].应用免疫荧光法检测可见，许多细胞表面都有VDBP结合[3].Mirkovic'等[4]的研究第一次证实了尿VDBP是独立于蛋白尿的一种肾小管间质损害生物标志物，并且出现于炎性反应及肾小管间质纤维化的早期。糖尿病肾病（diabeticnephropathy,DN）作为2型糖尿病（T2DM）的重要并发症之一，一直是研究的热点。除常见致病机制外，有研究表明慢性炎性反应在DN的发生发展中也起到重要作用[5],而巨噬细胞是介导肾脏炎性反应的关键细胞。Chow等[6]研究表明，巨噬细胞参与了DN的发病及肾间质纤维化的过程。目前已知VDBP参与T2DM的发生及进展[7-11],且有文献报道尿VDBP水平与DN程度成正比[12].但尚罕见相关研究探讨VDBP在DN各期患者中的表达水平及影响因素。故本研究采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测T2DM患者血、尿VDBP水平并分析其相关影响因素，以明确VDBP与DN的关系，为DN的诊断及治疗提供新的依据。

　　1对象与方法

　　1.1研究对象
　　
　　选取2013年8月-2014年2月在大连医科大学附属二院住院的T2DM患者66例。纳入标准：均符合1999年WHO糖尿病诊断标准[13],空腹血糖（FPG）≥7.0mmol/L,或糖负荷后2h血糖≥11.1mmol/L.排除标准：（1）合并尿路感染及其他部位感染者；（2）伴有肿瘤、心功能衰竭、T2DM急性并发症（如糖尿病酮症酸中毒）者；（3）近期应用肾毒性药物或摄入高蛋白食物者；（4）妊娠、哺乳期及服用避孕药物的女性。根据美国糖尿病协会（AmericanDiabetesAssociation,ADA）2007年指南推荐的尿微量清蛋白与尿肌酐比值（UACR），将患者分为3个亚组：正常清蛋白尿组（UACR<30mg/g）、微量清蛋白尿组（UACR30~300mg/g）和临床清蛋白尿组（UACR>300mg/g）[14].同时选取该院门诊的健康体检者20例为健康对照组。纳入标准：均接受口服75g葡萄糖耐量试验（OGTT）证实为糖耐量正常。排除标准：（1）心脏病、高血压、高脂血症、肝肾疾病者；（2）有内分泌及代谢性疾病病史者；（3）近期无高蛋白食物摄入史；（4）妊娠、哺乳期及服用避孕药物的女性。本研究通过该院伦理委员会的审查，受试者均签署知情同意书。

　　1.2方法
　　
　　（1）生化指标：受试者清晨空腹（禁食12h、禁饮8h）抽取静脉血5ml,1h内离心分离上清液送至该院检验中心测定FPG、糖化血红蛋白（HbA1c）、血肌酐（SCr）、血尿素（UREA）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、血清蛋白（ALB）；留取晨清洁中段尿20ml测定尿微量清蛋白以及尿肌酐。其余血样及尿样1h内离心，取上清液冻存-40.0℃冰箱，3个月内测定VDBP（ELISA法，中国优尔生公司）。（2）体质指数（bodymassindex,BMI）：固定专人采用同一测量工具测量身高、体质量，并计算BMI.（3）估算肾小球滤过率（eGFR）：根据简化MDRD公式计算，eGFR〔ml·min-1·（1.73m2）-1〕=186.3×〔SCr（g/L）〕-1.154×〔年龄（岁）〕-0.203×0.742（女性）。

　　1.3统计学方法
　　
　　采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，其中两两比较采用q检验；相关分析采用Pearson相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.14组一般资料比较健康对照组男10例，女10例；正常清蛋白尿组男12例，女10例；微量清蛋白尿组男11例，女11例；临床清蛋白尿组男10例，女12例，4组间差异无统计学意义（χ2=0.36,P=0.94）。4组年龄、TC、BMI间差异无统计学意义（P>0.05）；FPG、HbA1c、SCr、UREA、TG、HDL-C、LDL-C、ALB间差异有统计学意义（P<0.05,见表1）。

　　2.24组血VDBP水平比较健康对照组及正常、微量、临床清蛋白尿组血VDBP水平分别为：（44.83±15.65）、（312.25±29.57）、（330.92±49.28）、（338.30±50.05）mg/L,4组间差异有统计学意义（F=409.42,P<0.01）；其中正常、微量、临床清蛋白尿组与健康对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；而正常、微量及临床清蛋白尿3组比较，差异无统计学意义（P>0.05,见图1）。

　　2.34组尿VDBP水平比较健康对照组及正常、微量、临床清蛋白尿组尿VDBP水平分别为：（5.26±1.34）、（8.93±3.17）、（15.19±3.38）、（21.48±7.00）mg/L,4组间差异有统计学意义（F=58.66,P<0.01）；其中两两组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05,见图2）。因尿VDBP检测采用晨尿点标本，无24h尿标本检测准确，故依据UACR法，用尿肌酐对尿VDBP值进行校正（尿VDBP/Cr）。健康对照组与正常、微量、临床清蛋白尿组尿VDBP/Cr水平分别为：（4.25±1.89）、（10.76±7.02）、（23.01±11.39）、（41.58±17.10）mg/g,4组间差异有统计学意义（F=47.38,P<0.01）；其中两两组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05,见图3）。

　　2.4T2DM患者尿VDBP水平与eGFR的相关性分析Pearson相关分析显示，患者尿VDBP水平与eGFR呈负相关（r=-0.413,P=0.015,见图4）。

　　2.5T2DM患者血、尿VDBP水平与其他一般指标的相关性分析患者血VDBP水平为（301.52±20.26）mg/L,与FBG、HbA1c、UREA、SCr、TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALB均无相关性（P>0.05）。患者尿VDBP水平为（16.81±3.64）mg/L,与FBG、HbA1c、TG、TC、HDL-C、LDL-C均无相关性（P>0.05）；而与SCr、UREA呈正相关，与ALB呈负相关（P<0.05,见表2）。

　　3讨论

　　DN是T2DM的主要并发症之一，因其起病隐匿，早期就诊率低，后期迅速进展为终末期肾脏病（ESRD），而严重危害人类健康。因此，DN的早期发现、早期干预至关重要。DN的发病机制比较复杂，其中炎性反应在DN发生发展过程中起着重要作用[15-18].

　　在DN的病理改变中，巨噬细胞是介导肾脏炎性反应的关键细胞。Chow等[6]的研究表明，巨噬细胞参与了DN的发病及肾间质纤维化的过程。持续的高血糖状态、细胞趋化因子的生成、肾小球免疫复合物的沉积、肌成纤维细胞的数量以及IV型胶原沉积的程度与巨噬细胞的聚集和活化具有明显的正相关性。肾间质纤维化是各种慢性肾脏病的共同转归，而巨噬细胞是其发生和发展过程中的重要细胞基础。通过对人类T2DM患者的肾脏病理表现进行对比可见，肾小球硬化的程度与巨噬细胞的聚集程度密切相关，目前已证实，巨噬细胞参与DN发生与发展的机制是通过氧化应激实现的[19].

　　VDBP是一种组特异性成分、一种糖基化的α-球蛋白，属结合蛋白清蛋白家族，分子量为58kDa,主要由肝脏合成，由肾小球滤过，并可经受体介导被近端肾小管上皮细胞重吸收，有文献报道肾脏也分泌少量的VDBP[1].VDBP的主要生物学功能是结合并转运维生素D（VitD）及其代谢产物，但除了结合VitD及其衍生物外，VDBP还有其他生物学功能。近年研究发现，在一些酶（包括T淋巴细胞的唾液酸酶和B淋巴细胞的β-半乳糖苷酶）的脱糖基化作用下，VDBP可转化为一种强效的巨噬细胞活化因子（MAF），直接作用于内皮细胞，抑制血管生成，同时刺激巨噬细胞促使其攻击异常生长的内皮细胞[2].VDBP不仅可以通过使补体C5a这种趋化因子免于被蛋白酶水解，延长其寿命，还可结合于粒细胞表面，明显增强其对巨噬细胞等炎性细胞的趋化作用[20].应用免疫荧光法检测可见，许多细胞（如中性粒细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、胎盘滋养层细胞等）表面都有VDBP结合。Mirkovic'等[4]研究第一次证实了尿VDBP是独立于蛋白尿的一种肾小管间质损害生物标志物，尿VDBP与肾小管炎性损伤标志物肾损伤分子-1（KIM-1）、β2微球蛋白（β2-MG）、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（Cys-C）、1-甲基环丙烯（MCP-1）、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）相关联，并伴随肾小管间质损伤程度的加重而升高，出现于炎性反应及肾小管间质纤维化的早期，甚至早于肾间质纤维化的已知标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）。近年来研究发现，VDBP可通过介导炎性反应调节与糖尿病有关的细胞因子[7-11].有文献报道尿VDBP水平与DN程度成正比[12].

　　目前国内外尚罕见关于VDBP在DN各期患者中表达水平及影响因素的研究。本研究通过检测T2DM患者血、尿VDBP水平，发现：（1）T2DM各亚组患者血VDBP水平均明显高于健康对照组，而这3个亚组间血VDBP水平并无差异。患者血VDBP水平与FPG、UREA、SCr、ALB等一般指标均无相关性。T2DM患者血VDBP水平的特异性升高，不除外炎性反应等因素参与，具体机制需进一步研究证实，但这种升高的水平与DN的进展无相关性，不能通过血VDBP水平对DN进行分期，故本研究亦未进行血VDBP水平与eGFR的相关性分析。（2）T2DM各亚组患者尿VDBP（或尿VDBP/Cr）水平均明显高于较健康对照组，且伴随DN的进程，3个亚组间尿VDBP（或尿VDBP/Cr）水平亦逐渐升高，说明尿VDBP水平可应用于DN的诊断及分期。（3）通过尿VDBP与其他一般指标的相关性分析，发现患者尿VDBP水平与UREA、SCr呈正相关，而与eGFR呈负相关，这与既往文献报道一致[4].尿VDBP可经肾小球排出、肾小管重吸收，根据Mirkovic'等[4]的研究得知，由于肾间质纤维化程度加重使得尿VDBP重吸收减少，故尿VDBP水平伴随肾功能损害的加重而增加，本研究结果证实尿VDBP水平亦同样反映DN肾功能损害的进展。（4）通过尿VDBP与其他一般指标的相关性分析，还发现患者尿VDBP水平与ALB呈负相关，有文献报道应用免疫组化研究发现肾脏存在VDBP的基因表达[1],故患者尿VDBP的增多，除肾小管重吸收减少的因素之外，是否还存在肾脏分泌一部分VDBP的可能，可以通过进一步动物试验证实。（5）伴随DN的进展，尿清蛋白排泄的增多导致ALB的逐渐减少。结合本研究血、尿VDBP水平的综合分析，发现伴随DN的进展，尿VDBP排出明显增多，但血VDBP水平在DN各期中无明显差异，并明显高于健康对照组。这说明VDBP在T2DM及DN患者可能存在特异性升高，结合前文已知VDBP的免疫介导功能及趋化作用，可以推测VDBP可能通过巨噬细胞浸润途径参与T2DM及DN的发病及病情进展，可以进一步通过动物实验进行验证。

　　健康对照组及正常、微量、临床清蛋白尿组一般指标比较结果显示：（1）临床清蛋白尿组UREA、SCr水平明显高于其他3组。这与临床清蛋白尿期（即DNIV期）会出现GFR下降的理论一致。（2）临床清蛋白尿组TG水平高于健康对照组及正常清蛋白尿组，HDL-C低于健康对照组，LDL-C高于健康对照组；正常、微量、临床清蛋白尿组ALB水平均明显低于健康对照组，且临床清蛋白尿组ALB水平也低于微量、正常清蛋白尿组。以上结果符合DN后期会出现大量蛋白尿、低蛋白血症，导致肝脏代偿性合成蛋白增多从而出现脂代谢紊乱的理论。

　　本研究由于样本量较少，且ELISA法本身存在一定化验误差，关于VDBP与DN致病机制方面的关系还需进一步研究证实。T2DM患者血、尿VDBP水平均有明显升高。但本研究通过检测T2DM患者血及尿VDBP水平并分析其相关影响因素，发现伴随DN进展，尿VDBP水平逐渐增高，对评估DN的病情有一定的价值，其有可能成为DN新的早期诊断标志物，VDBP可能参与DN的病理生理过程，为DN的研究及治疗开拓了新的方向。