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维格列汀在糖尿病肾病大鼠肾脏保护中的效果

来源:学术堂 作者:姚老师
发布于:2016-01-18 共3252字
摘要

  糖尿病肾病(DN)是糖尿病主要的微血管并发症,其病理变化表现为肾小球、肾小管肥大,肾小球肾小管基底膜增厚,肾小球系膜区细胞外基质堆积及肾小球硬化[1].血管内皮生长因子(VEGF)是一种特异作用于血管内皮细胞的细胞因子,有研究表明,VEGF参与蛋白尿的产生和肾脏肥大形成,与DN关系密切[2].结缔组织生长因子(CTGF)在肾脏表达尤为丰富,它介导了转化生长因子-β(TGF-β)1促进细胞外基质积聚的效应,参与组织纤维化过程,促进肾脏肾小球系膜细胞外基质聚集、肾小球硬化和肾小管间质纤维化[3].给予二肽基肽酶-4抑制剂(DPP-4)维格列汀通过调控CTGF和VEGF的表达而发挥糖尿病肾脏保护作用,其国内外报道甚少。因此,本研究给予DN大鼠维格列汀治疗,通过检测主要反映DN病情进展的指标(血糖和24h尿蛋白)及检测反映肾小球硬化和肾小管间质纤维化的2个项目(CTGF、VEGF)血清学表达水平,旨在探讨维格列汀对DN大鼠肾脏的保护作用,现报道如下。

  1材料与方法

  1.1动物与试剂

  健康雄性SD大鼠60只,体质量180~200g,购自广东医学院实验动物中心;链脲佐菌素(STZ),美国sigma公司;DPP-4维格列汀,诺华制药有限公司产品;尿蛋白试剂盒购自南京建成科技有限公司;CTGF、VEGF酶联免疫试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。

  1.2糖尿病大鼠模型建立

  大鼠分为A、B、C 3组,A、B两组单次腹腔注射65mg/kg STZ,STZ用0.1mmo1/L无菌枸橼酸缓冲液配制(pH=4.5)。72h后摘除眼球取血测定血糖,血糖大于或等于16.67mmol/L的大鼠入组为糖尿病大鼠。连续4周测定血糖、24h尿蛋白,连续3d随机血糖大于或等于16.67mmol/L,24h尿蛋白大于30mg/(kg·d)者为DN组。然后分别给予维格列汀8mg/(kg·d)灌胃连续治疗8周和12周。C组为对照组,只给予生理盐水灌胃。

  1.3仪器与试剂

  血糖及24h尿蛋白采用速率法,罗氏AU600全自动生化分析仪及配套试剂测定;血清CTGF和VEGF检测采用ELISA,试剂由深圳晶美公司提供。奥地利AUTH2010全自动酶标仪比色分析试验数据,操作严格按照仪器及试剂使用说明书执行。

  1.4肾重指数检测

  各组大鼠喂养12周时称体质量,处死大鼠取双肾并去掉肾包膜,冰盐水冲洗后滤纸吸干,测双肾重量。根据公式:肾重/体质量=[双侧肾脏重量之和(g)/体质量(g)]×1 000进行计算。

  1.5肾脏组织HE染色及肾组织病理图像分析取新鲜肾脏组织用生理盐水冲洗干净,然后采用甲醛固定,常规脱水、透明、浸蜡、包埋,制成3μm石蜡切片,行HE染色。采用CIAS-1000型细胞图像分析系统对病理染色切片(×400倍)进行图像分析。每个切片随机选择8个正切的肾小球,测定肾小球平均截面积(MGA),取其平均值作为每个标本的MGA,并根据公式:肾小球平均体积(MGV)=1.25×3/2(MGA)计算MGV.

  1.6统计学处理采用SPSS19.0统计软件处理,计量资料以x±s表示,采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。多组间先进行确实数据方差分析,再用D检验进行组间比较。CTGF与VEGF相关性采用单因素直线相关分析进行处理。

  2结果

  2.1各组大鼠血糖、24h尿蛋白及CTGF与VEGF水平变化

  见表1.与DN组和对照组相比,维格列汀组血糖、24h尿蛋白、CTGF和VEGF差异均有统计学意义(P<0.05)。

  2.2 DN大鼠治疗前、后血液CTGF与VEGF水平比较

  见表2.由表2可见,DN大鼠治疗12周后血清CTGF与VEGF水平显着低于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05)。

  2.3各组大鼠模型肾重指数变化DN组、维格列汀组、对照组肾重指数分别是(11.02±0.89)、(9.85±0.45)、(6.40±0.39),维格列汀组肾脏肥大程度减轻,3组差异均有统计学意义(P<0.05)。

  2.4病理切片图像分析见表3.

  DN组MGA、MGV明显扩大,维格列汀各治疗组均有不同程度缩小,差异有统计学意义(P<0.05),而对照组、DN组MGA、MGV未见明显扩大。

  3讨论

  DN是糖尿病的微血管并发症之一,早期病理特征是肾小球肥大,肾小球及肾小管基底膜增厚,系膜区细胞外基质进行性积聚,后期表现为肾小球、肾小管间质纤维化,最终致蛋白尿和肾衰竭。DN发病机制比较复杂,目前尚不完全清楚,可能与遗传因素、高血糖、高血压、血脂异常等代谢紊乱及某些免疫因子调控相关。本研究给予DPP-4抑制剂维格列汀通过调控CTGF和VEGF的表达而发挥糖尿病肾脏保护作用,其国内外报道较少。

  VEGF是1989年从培养的牛垂体滤泡星状细胞分离出的一种相对分子质量为(35~45)×103的二聚体糖蛋白[4].近年强调微血管结构在肾脏疾病进展中的重要性,血管内皮生长因子CTGF、VEGF与DN的关系成为关注的热点。

  CTGF是1991年Bradham等首先在人脐静脉内皮细胞的条件培养基中发现的,它是一种由349个氨基酸组成,相对分子质量为(34~38)×103的富含半胱氨酸的分泌肽[5].CTGF作为TGF-β1的下游因子,在肾脏表达尤为丰富,它介导了TGF-β1促进细胞外基质积聚的效应,参与组织纤维化过程[6].它的过度表达促进肾脏肾小球系膜细胞外基质的聚集、肾小球硬化和肾小管间质纤维化。

  本研究通过测定DN大鼠血糖、24h尿蛋白、肾重指数和MGA、MGV变化,观察肾小球的病理形态改变及大鼠血清学VEGF和CTGF的表达水平。随着疾病进程加重,本研究结果显示,各组大鼠在早期就已出现多饮、多食、多尿等糖尿病表现。随着病情的进展,血糖及24h尿蛋白明显高于同期对照组,出现肾脏病理损伤加重等DN表现,由此表明研究过程中肾功能不断受损,其病理变化表现为肾小球、肾小管肥大,肾小球、肾小管基膜增厚,肾小球系膜区细胞外基质堆积及肾小球硬化。进一步检测反映肾小球硬化和肾小管间质纤维化2项指标CTGF和VEGF的血清学表达水平发现,DN大鼠血清CTGF和VEGF水平显着高于对照组,且经过维格列汀治疗后DN大鼠血糖及24h尿蛋白及CTGF和VEGF水平显着下降,且治疗12周后以上各项指标比治疗8周下降更明显,与文献[7]报道一致。薛菲等[2]认为,VEGF与尿清蛋白排泄率呈正相关,表明高水平VEGF会促进蛋白尿产生,促进肾脏组织损伤。本研究结果亦显示,经过维格列汀治疗后CTGF和VEGF水平均显着下降,且治疗前、后CTGF和VEGF 2项指标呈正相关关系,DN大鼠中CTGF和VEGF 2项因子明显升高于同期对照组,因此推测CTGF和VEGF在大鼠DN发生和发展过程中起到加速作用,进一步导致肾脏病理损伤加重,最终发展为DN所起的作用可能是一对相辅相成的免疫因子。

  CTGF是介导肾间质炎性反应最重要炎性反应趋化因子之一,在多种肾脏疾病的发病及进展中发挥作用,是关键性细胞因子之一,参与DN的病理过程,是导致糖尿病肾损害的重要原因[8].本研究结果显示,CTGF与DN大鼠弥漫性肾小球硬化与巨噬细胞浸润有关,提示长期高血糖刺激,使CTGF促使血管内皮细胞VEGF表达增加,其结果导致白细胞黏附增加、血管内皮细胞产生慢性炎性反应,进而促进DN形成。随DN进一步加重CTGF呈进行性上升趋势,导致肾小球高滤过、清蛋白排泄、肾小球肥大等,由此提示CTGF和VEGF参与了DN发病及发生和发展。

  肠促胰素类药物是目前用于治疗2型糖尿病较新的一类药物,肠促胰素类药物有两类:一类是胰高血糖素样肽-1类似物,一类是DPP-4抑制剂[9].临床研究显示,此类药物不仅可有效控制血糖,还能减少体质量增加、降低低血糖发生的风险。

  与此同时,临床试验及动物研究亦发现,肠促胰岛素类药物对DN具有保护作用,为DN的治疗提供了新的思路[10].维格列汀治疗组与DN组相比,不仅能明显降低血糖、尿蛋白,减轻肾脏体积,用药后肾组织病理损伤也减轻。说明维格列汀具有一定的肾脏保护作用,减少尿蛋白及肾脏保护作用更强。本研究证实,糖尿病患者血CTGF水平可作为诊断早期肾损害较敏感的指标,其水平也与DN严重程度呈正相关,有助于监测、判断其病程进展情况[11].提示CTGF与VEGF参与DN的发病过程,阻断或减弱其表达将成为DN更有效的治疗途径。早期对VEGF进行干预,如使用小分子VEGF受体抑制剂及抗黏附分子治疗,可降低血管高渗透性,减轻蛋白尿及肾小球肥大,同时阻断或减弱CTGF表达,将成为DN更有效的治疗途径。

  参考文献:
  [1]Mahmood D,Singh BK,Akhtar M.Diabetic neuropathy:therapies on the horizon[J].J Pharm Pharmacol,2013,61(5):1137-1145.
  [2]薛菲,刘惠兰,王银娜.血管内皮细胞生长因子水平及其基因多态性与2型糖尿病肾病的关系[J]中华肾脏病杂志,2007,23(12):813-814

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