维格列汀在糖尿病肾病大鼠肾脏保护中的效果

　　糖尿病肾病（DN）是糖尿病主要的微血管并发症，其病理变化表现为肾小球、肾小管肥大，肾小球肾小管基底膜增厚，肾小球系膜区细胞外基质堆积及肾小球硬化[1].血管内皮生长因子（VEGF）是一种特异作用于血管内皮细胞的细胞因子，有研究表明，VEGF参与蛋白尿的产生和肾脏肥大形成，与DN关系密切[2].结缔组织生长因子（CTGF）在肾脏表达尤为丰富，它介导了转化生长因子-β（TGF-β）1促进细胞外基质积聚的效应，参与组织纤维化过程，促进肾脏肾小球系膜细胞外基质聚集、肾小球硬化和肾小管间质纤维化[3].给予二肽基肽酶-4抑制剂（DPP-4）维格列汀通过调控CTGF和VEGF的表达而发挥糖尿病肾脏保护作用，其国内外报道甚少。因此，本研究给予DN大鼠维格列汀治疗，通过检测主要反映DN病情进展的指标（血糖和24h尿蛋白）及检测反映肾小球硬化和肾小管间质纤维化的2个项目（CTGF、VEGF）血清学表达水平，旨在探讨维格列汀对DN大鼠肾脏的保护作用，现报道如下。

　　1材料与方法

　　1.1动物与试剂

　　健康雄性SD大鼠60只，体质量180~200g,购自广东医学院实验动物中心；链脲佐菌素（STZ），美国sigma公司；DPP-4维格列汀，诺华制药有限公司产品；尿蛋白试剂盒购自南京建成科技有限公司；CTGF、VEGF酶联免疫试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。

　　1.2糖尿病大鼠模型建立

　　大鼠分为A、B、C 3组，A、B两组单次腹腔注射65mg/kg STZ,STZ用0.1mmo1/L无菌枸橼酸缓冲液配制（pH=4.5）。72h后摘除眼球取血测定血糖，血糖大于或等于16.67mmol/L的大鼠入组为糖尿病大鼠。连续4周测定血糖、24h尿蛋白，连续3d随机血糖大于或等于16.67mmol/L,24h尿蛋白大于30mg/（kg·d）者为DN组。然后分别给予维格列汀8mg/（kg·d）灌胃连续治疗8周和12周。C组为对照组，只给予生理盐水灌胃。

　　1.3仪器与试剂

　　血糖及24h尿蛋白采用速率法，罗氏AU600全自动生化分析仪及配套试剂测定；血清CTGF和VEGF检测采用ELISA,试剂由深圳晶美公司提供。奥地利AUTH2010全自动酶标仪比色分析试验数据，操作严格按照仪器及试剂使用说明书执行。

　　1.4肾重指数检测

　　各组大鼠喂养12周时称体质量，处死大鼠取双肾并去掉肾包膜，冰盐水冲洗后滤纸吸干，测双肾重量。根据公式：肾重/体质量=[双侧肾脏重量之和（g）/体质量（g）]×1 000进行计算。

　　1.5肾脏组织HE染色及肾组织病理图像分析取新鲜肾脏组织用生理盐水冲洗干净，然后采用甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制成3μm石蜡切片，行HE染色。采用CIAS-1000型细胞图像分析系统对病理染色切片（×400倍）进行图像分析。每个切片随机选择8个正切的肾小球，测定肾小球平均截面积（MGA），取其平均值作为每个标本的MGA,并根据公式：肾小球平均体积（MGV）=1.25×3/2（MGA）计算MGV.

　　1.6统计学处理采用SPSS19.0统计软件处理，计量资料以x±s表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。多组间先进行确实数据方差分析，再用D检验进行组间比较。CTGF与VEGF相关性采用单因素直线相关分析进行处理。

　　2结果

　　2.1各组大鼠血糖、24h尿蛋白及CTGF与VEGF水平变化

　　见表1.与DN组和对照组相比，维格列汀组血糖、24h尿蛋白、CTGF和VEGF差异均有统计学意义（P<0.05）。

　　2.2 DN大鼠治疗前、后血液CTGF与VEGF水平比较

　　见表2.由表2可见，DN大鼠治疗12周后血清CTGF与VEGF水平显着低于治疗前，差异有统计学意义（P<0.05）。

　　2.3各组大鼠模型肾重指数变化DN组、维格列汀组、对照组肾重指数分别是（11.02±0.89）、（9.85±0.45）、（6.40±0.39），维格列汀组肾脏肥大程度减轻，3组差异均有统计学意义（P<0.05）。

　　2.4病理切片图像分析见表3.

　　DN组MGA、MGV明显扩大，维格列汀各治疗组均有不同程度缩小，差异有统计学意义（P<0.05），而对照组、DN组MGA、MGV未见明显扩大。

　　3讨论

　　DN是糖尿病的微血管并发症之一，早期病理特征是肾小球肥大，肾小球及肾小管基底膜增厚，系膜区细胞外基质进行性积聚，后期表现为肾小球、肾小管间质纤维化，最终致蛋白尿和肾衰竭。DN发病机制比较复杂，目前尚不完全清楚，可能与遗传因素、高血糖、高血压、血脂异常等代谢紊乱及某些免疫因子调控相关。本研究给予DPP-4抑制剂维格列汀通过调控CTGF和VEGF的表达而发挥糖尿病肾脏保护作用，其国内外报道较少。

　　VEGF是1989年从培养的牛垂体滤泡星状细胞分离出的一种相对分子质量为（35~45）×103的二聚体糖蛋白[4].近年强调微血管结构在肾脏疾病进展中的重要性，血管内皮生长因子CTGF、VEGF与DN的关系成为关注的热点。

　　CTGF是1991年Bradham等首先在人脐静脉内皮细胞的条件培养基中发现的，它是一种由349个氨基酸组成，相对分子质量为（34~38）×103的富含半胱氨酸的分泌肽[5].CTGF作为TGF-β1的下游因子，在肾脏表达尤为丰富，它介导了TGF-β1促进细胞外基质积聚的效应，参与组织纤维化过程[6].它的过度表达促进肾脏肾小球系膜细胞外基质的聚集、肾小球硬化和肾小管间质纤维化。

　　本研究通过测定DN大鼠血糖、24h尿蛋白、肾重指数和MGA、MGV变化，观察肾小球的病理形态改变及大鼠血清学VEGF和CTGF的表达水平。随着疾病进程加重，本研究结果显示，各组大鼠在早期就已出现多饮、多食、多尿等糖尿病表现。随着病情的进展，血糖及24h尿蛋白明显高于同期对照组，出现肾脏病理损伤加重等DN表现，由此表明研究过程中肾功能不断受损，其病理变化表现为肾小球、肾小管肥大，肾小球、肾小管基膜增厚，肾小球系膜区细胞外基质堆积及肾小球硬化。进一步检测反映肾小球硬化和肾小管间质纤维化2项指标CTGF和VEGF的血清学表达水平发现，DN大鼠血清CTGF和VEGF水平显着高于对照组，且经过维格列汀治疗后DN大鼠血糖及24h尿蛋白及CTGF和VEGF水平显着下降，且治疗12周后以上各项指标比治疗8周下降更明显，与文献[7]报道一致。薛菲等[2]认为，VEGF与尿清蛋白排泄率呈正相关，表明高水平VEGF会促进蛋白尿产生，促进肾脏组织损伤。本研究结果亦显示，经过维格列汀治疗后CTGF和VEGF水平均显着下降，且治疗前、后CTGF和VEGF 2项指标呈正相关关系，DN大鼠中CTGF和VEGF 2项因子明显升高于同期对照组，因此推测CTGF和VEGF在大鼠DN发生和发展过程中起到加速作用，进一步导致肾脏病理损伤加重，最终发展为DN所起的作用可能是一对相辅相成的免疫因子。

　　CTGF是介导肾间质炎性反应最重要炎性反应趋化因子之一，在多种肾脏疾病的发病及进展中发挥作用，是关键性细胞因子之一，参与DN的病理过程，是导致糖尿病肾损害的重要原因[8].本研究结果显示，CTGF与DN大鼠弥漫性肾小球硬化与巨噬细胞浸润有关，提示长期高血糖刺激，使CTGF促使血管内皮细胞VEGF表达增加，其结果导致白细胞黏附增加、血管内皮细胞产生慢性炎性反应，进而促进DN形成。随DN进一步加重CTGF呈进行性上升趋势，导致肾小球高滤过、清蛋白排泄、肾小球肥大等，由此提示CTGF和VEGF参与了DN发病及发生和发展。

　　肠促胰素类药物是目前用于治疗2型糖尿病较新的一类药物，肠促胰素类药物有两类：一类是胰高血糖素样肽-1类似物，一类是DPP-4抑制剂[9].临床研究显示，此类药物不仅可有效控制血糖，还能减少体质量增加、降低低血糖发生的风险。

　　与此同时，临床试验及动物研究亦发现，肠促胰岛素类药物对DN具有保护作用，为DN的治疗提供了新的思路[10].维格列汀治疗组与DN组相比，不仅能明显降低血糖、尿蛋白，减轻肾脏体积，用药后肾组织病理损伤也减轻。说明维格列汀具有一定的肾脏保护作用，减少尿蛋白及肾脏保护作用更强。本研究证实，糖尿病患者血CTGF水平可作为诊断早期肾损害较敏感的指标，其水平也与DN严重程度呈正相关，有助于监测、判断其病程进展情况[11].提示CTGF与VEGF参与DN的发病过程，阻断或减弱其表达将成为DN更有效的治疗途径。早期对VEGF进行干预，如使用小分子VEGF受体抑制剂及抗黏附分子治疗，可降低血管高渗透性，减轻蛋白尿及肾小球肥大，同时阻断或减弱CTGF表达，将成为DN更有效的治疗途径。

　　参考文献：
　　[1]Mahmood D,Singh BK,Akhtar M.Diabetic neuropathy:therapies on the horizon[J].J Pharm Pharmacol,2013,61（5）：1137-1145.
　　[2]薛菲，刘惠兰，王银娜.血管内皮细胞生长因子水平及其基因多态性与2型糖尿病肾病的关系[J]中华肾脏病杂志，2007,23（12）:813-814