去白细胞输血器滤除疟原虫感染血液中WBC的效果

　　疟疾是危害人体健康最严重的热带病之一。疟原虫经蚊子传播，在人体主要寄生在红细胞内（infected red blood cell,iRBC）并大量繁殖，破坏 RBC,引发一系列严重后果。在疟疾的研究中，疟原虫感染的患者血液标本及鼠疟模型的小鼠疟原虫血液是基本的研究材料。然而在实验中首先面临的问题是如何排除宿主血液中的白细胞（white blood cell, WBC）DNA 的干扰，得到纯化的虫体。宿主 WBC 的存在可影响实验结果，在一定程度上增加研究难度、延长实验时间和提高成本。因此，如何去除原虫血样中的宿主 WBC,是实验成败的首要环节，对疟原虫的分子生物学、免疫学等研究方面尤为关键。

　　有关疟原虫标本纯化方法的探索，一直伴随着疟疾的研究不断进行。随着实验技术的进步，纯化方法也逐步更新。疟原虫的纯化主要经历了沉降法，洗涤法、离心法、纤维素柱层析法及过滤法等.纯化方法的改进除了以去除宿主 WBC 为主要目标外，其操作的简便性及低成本也是重要的指标。传统洗涤法、离心法等对宿主 WBC 去除效果有限，已逐渐被柱层析法及过滤法所取代。CF-11 纤维柱法是最常用的方法，价格低廉，缺点是耗时费力;商品化的滤器 Plasmodipur 价格昂贵，且来源受限;文献报道多需要结合两种以上技术：如密度梯度离心结合 CF-11 纤维柱沉降法,淋巴细胞分离液离心法结合 plasmodipur 等.Trang等建立了一步磁珠法去除 WBC 的方法，简便快捷，但需专用的器材，成本较高.Tao 等试制了无纺布（non-woven fabric,NWF）滤器用于间日疟原虫血的纯化，与 CF-11 法比较取得满意效果，而这种滤器形成产品还有待时日。

　　无纺布（NWF）具有吸附 WBC 的功能，作为过滤材料普遍用于临床输血前处理去除人体 WBC.目前去 WBC 输血器已广泛的用于国内外临床输血中的 WBC 过滤，在八十年代后开发出的以聚酯纤维无纺布作滤膜的第三代高效去 WBC 输血器，其 WBC 去除率可达 99.9% 以上，而第四代 WBC 滤器的 WBC 清除可达 99.9999%以上。临床用去 WBC 输血器一般用于 50 mL以上的血液处理，而疟原虫血样通常仅有几毫升，每只小鼠可采集虫血约为 1 mL 左右。那么临床用去 WBC 输血器能否直接用于疟原虫血样尤其是小鼠疟原虫血样的纯化呢？尚未见相关实验报道。为建立一种简便、实用、去 WBC 效果好且低成本的疟原虫纯化方法，本文采用临床去白细胞输血器对感染疟原虫的小鼠血液中的 WBC 去除效果进行了实验探讨。

　　1 材料与方法
　　
　　1.1 一般材料
　　1.1.1 实验动物及虫株 雄性瑞士种昆明远交系小鼠，6~8 周龄，体重 20~25 g,购于广州中山大学实验动物中心。伯氏疟原虫（Plasmodium berghei, Pb）ANKA 株由本室鼠鼠间血传保种。

　　1.1.2 主要试剂与仪器 一次性去白细胞输血器（型号 KF-WFR-B-200）购自成都市双陆医疗器械有限公司；DNA 提取试剂盒、PCR 试剂及电泳分子质量标准均购自宝生物工程（大连）有限公司，PCR 仪（杭州博日），TDL-40B-II 型低速台式离心机（江苏无锡瑞江分析仪器公司）。

　　1.2 方法
　　1.2.1 动物分组与处理 39 只小鼠随机分为 3 组：A 组（新鲜虫血组，n=18）、B 组（冻存虫血组，-80℃保存 6 个月，n=16）及 C 组（正常对照组，n=5）；A 组和 B 组每只小鼠分别由腹腔接种 200 mL1×107Pb 感染红细胞，C 组腹腔注射 200 mL 生理盐水。

　　1.2.2 原虫率计数 实验鼠于接种原虫后濒死前（6~9 d）采尾血涂片镜检，吉姆萨染色后计数 iRBC 数（原虫率）及观察疟原虫的形态。
　　
　　1.2.3 小鼠WBC过滤 眼球采血，0.1%肝素抗凝，涂片。血样立即用NVF滤器过滤或-80oC冰冻保存后过滤。过滤方法为：各微量血样（<1 mL,0.5~0.8 mL）用RPMI 1640培养基稀释至5 mL,混匀，取100 mL,用于过滤前用血球计数板对WBC和RBC的直接计数。稀释血样纯化前，先用10 mL RPMI 1640培养基湿化处理滤器（膜），接着用注射器将稀释好的血样缓慢的加入到滤器中：先取6份血样，分别调整流速为20 滴/min;40 滴/min及100 滴/min各2份，滤器和收集管的高度固定为80 cm,以确定最佳过滤条件；待血样经过滤器后，分别用约20mlRPMI 1640液冲洗滤器，收集过滤液，将滤过液置离心机3 000 r/min,离心10 min,弃上清，保留5 mL.用移液器在细胞沉淀的上缘吸取混有约50%液体的细胞沉淀10 mL,混匀涂片，染色镜检滤后WBC数、疟原虫形态及密度。混匀其余的细胞悬液，从中取100 mL,用于过滤后WBC和RBC的直接计数。WBC清除效果的评价采用对比过滤前后血液中的WBC直接计数及血片镜检10个高倍视野（1 000 个红细胞/ 高倍视野） 中白细胞的平均数目的方法进行，疟原虫感染率为iRBC/1 000 个红细胞×100%.

　　1.2.4 原虫血样DNA提取、PCR扩增 取白细胞滤过后的感染Pb新鲜及冻存鼠血，按照试剂盒说明书提取DNA,对小鼠（宿主）和疟原虫GAPDH基因片段分别进行PCR扩增。引物序列如下：小鼠GAPDH: F:5'-ACAGTCAAGGCCGAGAATGGG-3', R:5'-ACGACATACTCAGCACCGGC -3'; PbGAPDH: F: 5'-TAAAGAAGCATCTGAGGGTC-3',R: 5'-ATCATTTAAGGCAAGACCAG-3'.PCR扩增条件： 95℃3 min;95 ℃ 15 s, 57 ℃30 s,72℃30 s, 35个循环；72 ℃10 min.2%琼脂糖对PCR产物进行电泳后结果分析。

　　1.3 统计学处理
　　采用 GraphPad Prism 5.0 统计软件进行数据分析。多组间比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA），两组间比较采用独立样本 t 检验或 Mann Whitney test,均用（ X ±s）表示，P<0.05 为差异具有统计学意义。

　　2 结果
　　
　　2.1 Pb感染小鼠虫血NVF滤器过滤流速对过滤效果的影响
　　分别对流速为20 滴/min;40 滴/min及100 滴/min的去除WBC效果进行比较，血涂片及直接计数WBC去除率没有差异，99.25%~99.75%;滤过时间<1 min.

　　2.2 新鲜血样及冻存血样的WBC去除效果比较
　　WBC滤过后的结果A、B、C三组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；WBC直接计数和血片镜检间接计数结果一致；新鲜血RBC的回收率C组明显高于A组。差异具有统计学意义（P<0.05）；而B组经-80℃冻存后，发生RBC溶血，见表1.滤过后的血涂片上疟原虫密度及形态没有见到明显变化，见图1.疟原虫RBC感染率由于RBC的破裂无法准确计数，以半定量表达，与滤过前比较无明显差异。【图1】


　　
　　2.3 疟原虫基因与小鼠基因的表达
　　取 4 份 Pb 感染小鼠血样，新鲜与冻存血各 2 份，经 WBC 过滤去除后，其中，经 PbGAPDH引物 PCR 扩增后均出现阳性条带，而经小鼠 GAPDH 引物 PCR 扩增后结果均为阴性。见图 2.【图2】

　　
　　3 讨论
　　
　　临床用去白细胞输血器由多层聚酯纤维无纺布制成。其原理是依靠滤材的筛滤和吸附作用，利用WBC与其他血细胞的直径差异和通过滤材时变形能力的差异，以及滤材表面对血细胞吸附力的区别使WBC与其他血细胞分开，将血液中的微聚体、WBC滞留在滤材上，而让血液中的其他成分通过，从而达到去除白细胞预防或减少输血反应的目的.一次性去白细胞输血器通常由穿刺器、软管、过滤件、空袋等组成，容量多为200 mL,临床应用普遍，而用于去除疟原虫血样中的WBC则是初次尝试。疟原虫血样不论来自病人或小鼠模型，均具有样本量小的特点，本实验所用的鼠疟标本每份都在1 mL以内，将血样直接稀释至5 mL,结果显示，WBC平均去除率新鲜虫血标本为（99.90±0.07）%,冻存虫血标本为（98.38±0.90）%,并未受到血液稀释、血浆蛋白减少的影响，可以正常有效的滤过；过滤时的样本流速对WBC的过滤效果亦无明显影响。

　　样本的新鲜与否对WBC的去除效果无明显影响，但对RBC的回收影响明显：正常对照组RBC回收率为（93.71±1.74）%,新鲜虫血组为（78.48±3.87）%,明显降低；而冻存虫血则因溶血无法计算。通过染色镜检WBC滤过后的血片发现，A组部分、B组疟原虫所寄生的RBC几乎全部消失，涂片中可见较多细胞碎片。通常在iRBC中，由于RBC内疟原虫的不断生长成熟，可造成所寄生的RBC形态改变，由正常的双凹圆盘形向球型变化，引起面积/体积比值减小， 造成变形能力下降，脆性增加；当RBC通过滤器时，部分变形能力差的RBC易受损破裂；经过低温保存的虫血，RBC则更易破裂导致无法计数。Tao等报道的疟原虫感染血液的WBC滤过后RBC回收率达到了94.39%~96.66%,远高于我们的实验结果；经对比，本文所用血样的平均原虫率A组18.33%,B组43.69%,显着高于文献所用样本的原虫率（15~82/10 000,平均0.29%），由此推测，原虫率的高低可能是导致RBC回收率降低的直接因素之一，而RBC回收率的高低并不影响后续分子生物学的研究。经滤器过滤前后，疟原虫的形态及虫体密度未发现明显改变。

　　PCR技术对可能残留的宿主WBC进行小鼠GAPDH基因扩增，证明排除了宿主WBC DNA的干扰，可满足后续进行分子生物学、免疫学研究的要求。

　　综上所述，去白细胞输血器用于疟原虫感染血液中WBC的滤过去除，获得满意效果。与传统的CF11纤维素粉末填充柱等方法比效，操作更为简便;与Plasmodipur滤器（Euro-Diagnostica）方法及磁珠法比较，可以达到同样甚至更优的WBC去除效果，但成本更低，来源方便。NVF滤器一步法是一种快速简便纯化浓缩疟原虫血的实用方法。

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