优化高效液相色谱法检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留情况

　　诺氟沙星(NOＲ)、恩诺沙星(ENＲ)、环丙沙星(CIP)、达氟沙星(DAN)和沙拉沙星(SAＲ)为常见的氟喹诺酮类抗菌剂，目前在畜禽生产中被广泛应用． 此类药物使用不当导致的药物残留可能直接危害人体健康，也可能使致病菌产生耐药性，间接对人类健康造成影响． 多个国家和地区均规定了氟喹诺酮类药物的最高残留限量． 检测动物源食品中氟喹诺酮类药物残留的方法有微生物法、酶联免疫法(ELISA)、毛细管区带电泳法、电解分析法、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱 － 质谱联用法(HPLC-MS)等． 目前，在鸡肉产品的检测中，常采用的方法是《动物性食品中氟喹诺酮类药物残留检测 － 高效液相色谱法》(农业部 1025 号公告 14-2008)． 本试验以此标准为基础，简化了试验前处理方法，优化了检测过程． 经试验验证，该法非常适合大批量处理样品，大量节省了处理时间和所需耗材，较大幅度降低成本，方法的灵敏度和回收率均可满足我国现行兽药残留检测分析的要求．
　　
　　1 材料与方法

　　1． 1 药品和试剂

　　恩诺沙星对照品、环丙沙星对照品、诺氟沙星对照品、达氟沙星对照品、沙拉沙星对照品，均为中国兽医药品监察所产品，磷酸二氢钾、磷酸、三乙胺、氢氧化钠溶液(分析纯，广州试剂厂)，乙腈(色谱纯，Fisher 公司)．
　　
　　1． 2 仪器和设备

　　Agilent 高效液相色谱仪( 美国 Agilent 公司) 配荧光检测器，高速匀质机及振荡器(德国 IKA 公司)，高速台式冷冻离心机(美国 Thermo 公司)．
　　
　　1． 3 试液配制

　　分别称取恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星对照品各10 mg，置于同一个 10 mL 容量瓶中，用 0.05 mol·L－ 1的氢氧化钠溶液溶解定容至刻度，制得质量浓度均为 1 mg·mL－ 1的混合储备溶液． 准确称取达氟沙星对照品10 mg，0. 05 mol·L－ 1的氢氧化钠溶液溶解定容至 10 mL，使其质量浓度为 1 mg·mL－ 1． 准确称取沙拉沙星对照品10 mg，0. 05 mol·L－ 1的氢氧化钠溶液溶解定容至 10 mL，使其质量浓度为 1 mg·mL－ 1．置 2 ～8 ℃冰箱中保存备用，有效期 1 个月．取上述恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星的混和储备液 100 μL，达氟沙星储备液 20 μL，沙拉沙星储备液 200 μL，置于同一个 100 mL 容量瓶中，用流动相定容至刻度，配置成恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的质量浓度为 1 μg·mL－ 1，达氟沙星质量浓度为0. 2 μg·mL－ 1，沙拉沙星质量浓度为 2μg·mL－ 1的混合标准溶液．提取液:称取 2 g 三氯乙酸于容量瓶中，加水至100 mL，制得的三氯乙酸溶液与乙腈按体积比 3 ∶ 1的比例混合，搅拌均匀，得到提取液．磷酸/三乙胺溶液:取磷酸 3. 4 mL，用水稀释至1 000 mL，配成 0. 02 mol·L－ 1的磷酸溶液，用三乙胺调 pH 至 2. 4． 临用配制(易产生沉淀)．
　　
　　1． 4 测定方法

　　1． 4． 1 供试材料的制备 将市售的鸡肉样品用高速匀浆机绞碎得到供试试料，将空白鸡肉样品绞碎得到空白试料，在空白试料中添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试料．
　　
　　1． 4． 2 提取与净化 称取 1 g 试料，置于匀浆杯中，加提取液 4 mL，高速匀浆 1 min． 匀浆液转入 15 mL聚丙烯离心管中，振荡 30 min，16 000 r/min，离心 8min，取上清液过 0. 2 μm 滤膜，装入进样瓶，待测．
　　
　　1． 4． 3 色谱条件 色谱柱:Agilent TC-C18250 mm ×4. 6 mm(i． d)，粒径 5μm． 流动相:V(0. 02 mol ·L－ 1磷酸/三乙胺溶液) ∶ V (乙腈) = 80 ∶ 20． 流速:1mL·min－ 1． 检测波长:激发波长 280 nm ;发射波长450 nm． 进样量:20 μL．
　　
　　1． 5 线性范围与检出限

　　空白样品中加入混合标准液配制成的诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、达氟沙星、沙拉沙星系列标准溶液． 高效液相色谱仪检测后，以峰面积为纵坐标，药物质量浓度为横坐标，进行线性回归分析． 在空白样品中添加不同质量浓度混合标准溶液，按“1. 4”的方法进行处理，检测后取信噪比 S/N = 3 对应的样品浓度为方法检出限(LOD)，信噪比 S/N =10 对应的样品浓度为方法定量限(LOQ)．
　　
　　1． 6 回收率和精密度

　　向空白待测样品中分别添加 3 个浓度水平的混合标准液，按“1. 4”的方法进行处理，每个浓度重复5 次，连续做 3 个批次，计算回收率和变异系数．
　　
　　2 结果与分析
　　
　　2． 1 色谱分析

　　在试验选定的条件下，测得诺氟沙星的保留时间为 6. 67 min，环丙沙星为 7. 19 min，达氟沙星为8. 18 min，恩诺沙星为 9. 07 min，沙拉沙星为 12. 93min，峰形尖锐，分离完全，空白组织样品在上述保留时间无干扰峰出现(图 1)．
　　
　　2． 2 方法的检出限及标准曲线

　　空白鸡肉样品中添加不同质量浓度的标准工作溶液 ，诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的残留定量限为 10 μg · kg－ 1，达 氟 沙 星 的 残 留 定 量 限 为 2μg·kg－ 1，沙拉沙星的残留定量限为 20μg·kg－ 1．诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的线性范围为 10 ～100 μg·kg－ 1，达氟沙星为 2 ～20μg·kg－ 1，沙拉沙星为 20 ～200 μg·kg－ 1． 对质量浓度不同的混合标准使用液进行色谱分析，工作曲线的线性范围、回归方程、相关系数见表 1． 可见，本方法灵敏度高、线性范围较宽，有一定的实用价值．【表1】

　　2． 3 方法的回收率与精密度

　　对鸡肉样品分别进行4 个浓度的添加试验，测得的回收率为84.71% ～99.66%，批内变异系数为0．20% ～4. 42% ，批间变异系数为 0. 33% ～2. 68% (表 2)．
　　
　　2． 4 抽样检测
　　
　　从市场上购买 30 个鸡肉样品，每份样品 2 个重复，按本方法进行制样和检测，结果发现一例鸡肉样品中诺氟沙星残留量为 43. 5 μg·kg－ 1，平行样品中诺氟沙星的质量浓度为 41. 4 μg·kg－ 1，其余样品均未检出氟喹诺酮药物的残留． 表明该方法检测鸡肉中氟喹诺酮类药物残留量的重现性非常好，相对偏差保持在 3%之内，数据可靠．
　　
　　3 讨论与结论
　　
　　3． 1 样品前处理方法的优化

　　动物源食品中基质干扰复杂，富含脂肪和蛋白质，选择并优化样品的前处理方法对结果的准确性尤为重要． 本试验在农业部 1025 号公告-14-2008 所采用方法的基础上，对样品的前处理过程进行了一定的优化． 该标准检测方法采用磷酸盐缓冲液提取完后，离心取上清液，过固相萃取柱，从而除去样品中的杂质． 本试验的提取液由乙腈与质量分数为2% 的三氯乙酸按体积比 1∶ 3 混合而配得，蛋白质在酸性条件下变性，离心出沉淀除掉杂质，而提取液中加入乙腈也与流动相中乙腈比例吻合，出峰较好．比较其他相关研究，仲锋在鸡组织中检测氟喹诺酮类药物残留量的回收率为 70% ～107%，变异系数小于 10%;陈红等在鸡排泄物中检测氟喹诺酮类药物的回收率为 75% 以上，批内变异系数在2. 2% ～ 10% 之间，批间变异系数在 6. 2% ～ 13. 0%之间;而本试验测得的回收率为 84. 71% ～99. 66%，批内变异系数为 0. 20% ～ 4. 42%，批间变异系数为0. 33% ～ 2. 68% ． 相较而言，本试验的回收率有了明显稳定的提高，精密度和准确度也相应改善了，定量限能满足日常采集样品的检测范围，而且检测的效率大大增加，节省了柱子的成本，减少了处理的时间，非常适用于样本量较大时的残留检测．
　　
　　3． 2 检测方法的稳定性

　　将新鲜配制的混合标准工作液 50 μg·kg－ 1于 4℃ 冰箱中避光保存 1、3、5、7 d 后上机检测，结果表明，被测药物保留时间基本不变，但浓度明显降低，可见标液在保存过程中不稳定，因此在测定过程中应该做到现用现配，处理完后的样品也应及时上机．

　　3． 3 结论

　　本试验在农业部 1025 号公告-14-2008 所采用方法的基础上，对样品的前处理过程进行了优化，使样品处理快捷便利，灵敏度高，重现性好，明显降低批量样品的检测成本，可有效应用于鸡肉食品品质的日常监控．
　　
　　参考文献:

　　［1］ 李俊锁，邱月明，王超． 兽药残留分析［M］． 上海:上海科学技术出版社，2002: 365-390．
　　［2］ WINTEＲ Ｒ W，KELLY J X，SMILKSTEIN M J． Antima-larial quinolones: Synthesis，potency，and mechanisticstudies［J］． Exp Parasitol，2008，118(4) :487-497．
　　［3］ 朱蓓蕾． 动物性食品药物残留［M ］． 上海: 上海科学技术出版社，1994: 115．