不同来源成骨细胞体外培养比较

　　骨的形成和重塑需要多种细胞的协作，其中成骨细胞发挥了至关重要的作用。成骨细胞不仅调节骨的矿化，还间接调节破骨细胞的骨吸收功能，它的数量和功能变化直接影响骨的生物学特性。

　　目前用于研究成骨细胞生物学特性的细胞模型多种多样，包括不同种属来源的原代细胞和永生化或是恶性肿瘤细胞系。但这类细胞的生物学特性和人成骨细胞间存在一定的差异。在选择某个成骨细胞模型实验之前，需要对其生物学特性进行合理评估，以增加实验结论的可靠性。例如，选用骨肉瘤细胞系取材方便，不受伦理问题的约束，且有着更好的再现性；而人原代细胞具有的优势显而易见，其生物学特性与在体的成骨细胞更为接近，所以在临床前及临床实验中应用更广。因此，本篇综述将讨论不同种类的成骨细胞，包括各种种属来源的原代成骨细胞和细胞系，为体外实验选择合适的成骨细胞模型提供参考。
　　
　　1 原代成骨细胞

　　1. 1 人原代成骨细胞

　　与其他种属的原代细胞或者细胞系相比，人原代成骨细胞更为贴近临床真实状态。但人原代成骨细胞在分离出来之后将会保持其已经分化的表现型，即这类细胞将会在不同的细胞群之间表现出异质性，而异质性是由取材部位和样本年龄等因素不同引起[1].分离人原代成骨细胞的主要方法是：酶解法和组织培养法，但这些方法步骤较为繁琐，耗时较长，不容易获取目的细胞[2].一些研究报道，酶解法会对随后的体外实验有影响，具体表现为，以酶解法得到的细胞，比组织培养的细胞增殖快，但 ALP活性要低一些[3].不仅如此，与成骨细胞表型变化相关的基因表达和蛋白合成也受到供者年龄的影响。目前为止，已经证明多种因素对人原代成骨细胞的生物学特性有影响，其中供者的性别、年龄、取材位置和取材方法的影响尤为突出。至于哪些影响因素应该作为细胞模型的纳入标准现在还没有统一的认识。

　　1. 2 其他种属的原代成骨细胞

　　由于人原代成骨细胞获取困难且存在细胞表型的异质性，科学家们开始尝试从其他动物体上分离培养原代成骨细胞用于体外研究。与人原代成骨细胞相比，动物原代成骨细胞获取简便。动物样本可以更好的控制纳入标准，控制样本的年龄、性别、体重和取材位置等。但使用其他种属的原代成骨细胞有着明显的弊端，种属之间的差异可能会使得出的结论与使用人原代成骨细胞得出的结论不同[4].

　　1994 年，美国食品药品监督管理局批准使用大鼠的原代成骨细胞作为临床前和临床药物疗效评估模型，用以治疗和预防绝经后骨质疏松[5].考虑到大鼠骨骼样本容易获取且基因组序列已知，大鼠的原代成骨细胞被广泛用于研究激素对细胞表型的影响及评估高分子聚合物或生物材料骨性诱导和细胞毒性[6].1983 年，Ecarot-Chartier 等[7]通过新生小鼠颅骨组织块培养的方式首次分离出小鼠原代成骨细胞。影响鼠原代成骨细胞表现型的主要是样本年龄和取材位置[8].其他种属的原代成骨细胞来自牛、羊和兔。与啮齿类动物相比，这些种属来源的细胞使用较少。

　　2 细胞系

　　与原代细胞相比，细胞系的优势有：无限传代、容易获取和表型的相对稳定性等。但是，有学者报道经过多次的传代之后，有些细胞系出现明显的表型异质性。而且不管是非转化或是转化的细胞系，都被固定在分化的某一阶段，没法反应正常成骨细胞全面的表型特征。不仅如此，恶性细胞系的增殖是非生理模式，其他细胞所具有的接触抑制等相关生物学特性被改变[9].即便如此，细胞系在成骨细胞模型中还是得到了广泛的使用。即便如此，细胞系在成骨细胞模型中还是得到了广泛的使用。最为常用的细胞系有：人源的 MG-63、大鼠源的 ROS 17/2 和小鼠源的 MC3T3- E1.

　　2. 1 MG-63 细胞系

　　1977 年 Billiau 等[10]在 14 岁男性左侧股骨末端的近皮质骨肉瘤中分离出这株细胞。MG-63 增殖迅速，不存在接触抑制，这一点被利用来生产干扰素[11].MG-63 细胞系不具有成熟的成骨细胞表型，关于 MG-63 分化和矿化特性的研究尚存在争议。

　　Kumarasuriyar 等[12]报道，MG-63 可作为良好的分化和矿化模型。在培养 15d 之前，MG-63 分泌的 ALP活性增加，随后逐步降低为正常水平，但Ⅰ型胶原的表达量在培养的第二周才增加。在培养的第 15 天和第 29 天分别检测出骨钙素（Osteocalcin,OCN）和骨粘连蛋白（Osteonectin,ON）的表达，但是 Runt 相关转录因子 2 和骨桥素（Osteopontin,OPN）直到培养的第 28 天才表达。Pierschbacher[13]和 Saldana[14]分别在1988 年和2011 年报道 MG-63 细胞系的 ALP活性很低，且不能够完成矿化。MG-63 对维生素 D3和 PTH 的反应和人原代成骨细胞相似。MG-63 相关蛋白的分泌具有维生素 D3刺激的时间和计量依赖性[15].有学者证明，MG-63 分泌的细胞外基质成分与人原代成骨细胞不同，MG-63 分泌白凝胶酶和金属蛋白酶组织抑制因子，但是没有Ⅰ型胶原 α1和 α2 链的羧基端前肽[13].由于以上特点，MG-63细胞系是用来研究激素对成骨细胞调节作用的良好模型。而 MG-63 细胞系分泌的细胞外基质与原代细胞存在的差异限制了其在成骨细胞表型分化和基质矿化方面的研究。

　　2. 2 ROS 17 /2 细胞系

　　此细胞系来源于 ACI 大鼠自发的肿瘤，经过多次皮下接种后形成的稳定细胞系。Majeska 等[16]致力于此细胞系的建立与研究，发现在 PTH 或维生素D3作用下 ROS 17/2 表现出较强的腺苷酸环化酶和ALP 活性。ROS 17 /2. 8 为 ROS 17 /2 的亚克隆，它在合适培养条件下可结构性的表达Ⅰ型胶原（Type-I collagen,COL-Ⅰ）mRNA,并完成矿化[17].Noda等[18]发现，在转化生长因子（Transforming growthfactor,TGF） 作用下，ROS 17 /2. 8 合成 ALP、COL-Ⅰ、ON 和 OPN 增加，但 OCN 合成减少。

　　2. 3 MC3T3-E1 细胞系

　　它是应用非常广泛的小鼠源性前成骨细胞模型。经 3d 的培养，MC3T3-E1 即能够在体外增殖且分泌 COL-Ⅰ，与此同时，ALP 的活性从培养的第 3天开始增加直到第 21 天完成矿化为止，矿物质于第14 天开始沉积[19].抗坏血酸和 β 甘油磷酸钠是MC3T3-E1 完成矿化的前提条件，在缺乏此类诱导剂时，MC3T3-E1 产生的 ALP 活性很低，没法完成正常的矿化[20].MC3T3-E1 的分化受到多种因素的调节，包括培养基、血清、细胞因子和生长因子[21].在加入全营养的胎牛血清时，细胞在分化早期具备较强的增殖能力，且在增殖后期细胞 ALP 活性、mRNA和蛋白的合成均增加[22].虽然 MC3T3-E1 是一种细胞系，但是在多次传代后其增殖能力下降，传 60代之后细胞出现不连续的细胞周期，发生复制性衰老[23].基于以上特性，MC3T3-E1 是研究骨骼形成和重塑的良好细胞模型。

　　2. 4 SaOs-2 细胞系

　　1987 年 Rodan 等[24]从11 岁的白人女性分离出SaOs-2 细胞系并对其进行研究。此种细胞系具有成熟 的 成 骨 细 胞 表 型，碱 性 磷 酸 酶 （ Alkalinephosphatase,ALP） 活性较其他骨肉瘤细胞系高得多。在培养的早期其 ALP 活性与人原代成骨细胞相似，但是在相同条件培养 14d 之后，其活性要高出人原代细胞 120 倍[14].由于 SaOs-2 细胞系合成分泌 ALP 的特点，在培养时加入地塞米松和磷酸盐的量要适当减少。SaOs-2 细胞系分泌的 COL-Ⅰ和人原代细胞相似，但是其赖氨酰基羟基化水平较高[25].此细胞系分泌正常量的细胞因子和生长因子，同时表达甲状旁腺激素（Parathyroid hormone,PTH） 和维生素 D3的受体[26].

　　2. 5 hOB 细胞系

　　即 the adult human osteoblast-like cell line,hOB的建立是将 SV40 病毒的大小 T 抗原转染到 68 岁的一个正常女性的成骨细胞中。hOB 分化良好，能够对类固醇激素起反应，非常接近成熟的成骨细胞表型。此细胞系能够转录出 COL-Ⅰ、OPN、TGF 和白细胞介素-1（IL-1），且在维生素 D3作用后 OCN和 ALP 的转录和翻译均增加。hOB 上表达功能性的雌激素和雄激素受体，但无 PTH 的受体[27].

　　2. 6 hFOB 细胞系

　　即 the human fetal osteoblast cell line,科学家将SV40 病毒大 T 抗原的温度敏感突变体 tsA58 转染到自发流产胎儿组织分离得到的成骨细胞中，从而建立了 hFOB.hFOB1. 19 是这个细胞系中分泌 ALP活性最高的克隆，其 ALP 和 OCN 的分泌对维生素D3存在剂量依赖性。分化的 hFOB 表达高水平的OPN、ON 和 COL-Ⅰ。甲状旁腺激素可以使得 hFOB的 cAMP 水平增加。另外，在细胞汇合时 hFOB 可形成钙化结节[28].

　　2. 7 CAL72 细胞系

　　Rochet 等[29]

　　于 1999 年建立了一株新的人骨肉瘤细胞系，与之前已建立的所有骨肉瘤细胞系相比，其生物学特性及表型更加接近正常的成骨细胞。

　　CAL72 为研究成骨细胞在造血细胞生长分化中的作用提供了良好的模型。与其他骨肉瘤细胞相比，其呈现出单一细胞因子表达谱的特点，这与之前研究较为充分的 MG-63 和 SaOs-2 相比更加接近正常的成骨细胞，并且 CAL72 与前两个细胞系不同，不会抑制造血克隆的生成。

　　2. 8 UMR 106 细胞系

　　这株骨肉瘤细胞系于 1976 年由 Martin 等[30]建立。UMR 106 起源于由 P32诱导的恶性骨源性肉瘤。

　　此细胞系能够分泌 ALP、COL-Ⅰ、前列腺素和胶原酶。不仅如此，UMR 106 还表达有表皮生长因子、PTH 和维生素 D3的受体，所以其可在这些因子的作用下完成矿化。UMR 106 有 2 株亚克隆，UMR106-01 和 UMR 106-06,就目前研究所知，这 2 株亚克隆的唯一区别在于 UMR 106-06 表达有降钙素受体[31,32].

　　2. 9 UMR 201 细胞系

　　此细胞系是来自新生大鼠颅骨的非转化细胞系。UMR 201 由 Ng 等[33]于1988 年建立，它是非永生化的细胞系，其只能传代 12 次，具有前成骨细胞的表型特征。在加入促分化试剂之前，UMR 201 检测不出 ALP 的表达，但在加入维甲酸之后，ALP 合成量大大提高，并具有很高的活性。TNF、地塞米松和维生素 D3能够调节 UMR 201 对维甲酸的反应性[34].由于以上原因，UMR 201 可组细胞向成骨细胞方向分化的研究模型，也可用以研究体内激素和各种生长因子对成骨细胞分化的调节及其相关机制。

　　2. 10 RCT 细胞系

　　1986 年 Jat 和 Sharp[35]将含有 SV40 大 T 抗原cDNA 的逆转录病毒转染到从胚胎大鼠颅骨中分离的成骨细胞中，从而建立了 RCT 细胞系。RCT-1 来自较早分离下来的胚胎大鼠颅骨成骨细胞，表现出成骨细胞特性，比如在维甲酸的作用下，表达出ALP、Ⅰ 型胶原和对 PTH 敏感的腺苷酸环化酶。

　　RCT-3 则来自晚期分离下来的成骨细胞，它的特点是持续性表达除骨钙蛋白以外的成骨细胞的各种标志。

　　2. 11 KS-4 细胞系

　　此细胞系的获得是将 c-Ha-ras-1 基因分离的小鼠颅骨成骨细胞中。其特点是在细胞汇合之后 ALP活性很低，Ⅰ型胶原产量低，且 PTH 作用后 cAMP生成量少。不仅在翻译水平，在转录水平上 KS-4 合成的Ⅰ型胶原、骨粘连蛋白和骨蛋白多糖ⅠmRNA均较少，但是骨钙蛋白正常。更为重要的特点是在与脾细胞共培养时，KS-4 可促进破骨细胞的生成[36].

　　3 总结

　　正确的实验设计对于解决特定问题来说不可或缺，而选择合适的模型是其中重要一环。本篇综述具体比较了不同来源成骨细胞之间的异同。

　　根据前文总结，人原代成骨细胞适用于体外骨生理学研究的各个方面。因为不能完全控制细胞供体的纳入标准，供体相关因素在一定程度上会影响到分离得到的成骨细胞表型，所以在供者捐献细胞之前需要对其进行准入控制。其他种类的原代细胞，特别是大鼠原代细胞适用于骨再生和重建过程的研究。此细胞最大的优势在于与人原代成骨细胞相比取材具有更好的同质性，即可以做到对动物的年龄、性别和取材位置标准化的控制。

　　细胞系是更为同质性的细胞群体，用于某一特定阶段成骨细胞表型的研究。细胞系在早期评价药物的治疗效果和细胞的相容性上有着不可替代的作用。但是其并不能完全反映原代细胞的特性。综述中所列举的细胞系中，MC3T3-E1 替代人原代成骨细胞更为可靠，所以应用领域更广。但是种属之间的差异使得证明的结论推演到临床应用困难重重，所以由细胞系得出的结论还需经过多种细胞模型的检验。

　　最后需要指出的是还有很多其他因素会影响到体外培养细胞的状态。例如，培养基的类型、培养基中的添加剂和培养细胞的密度等都可能会干扰结论。经过长时间的发展，成骨细胞体外培养已经有标准化的方法。虽然这种标准化不能完全反映在体细胞的自然状态，但是越来越多的学者致力于模拟细胞自然生长状态培养系统的建立。已有研究证实，与标准化的单层细胞培养相比，3D 环境促进成骨细胞的成骨过程[37].