干细胞来源微囊泡在再生医学中的应用进展

　　引言

　　微囊泡（microvesicles,MVs）是指直径范围为20~1 000nm不同类型的膜包裹结构，可从多种类型细胞中释放，也可被多种细胞摄入，含有与母细胞相似的脂类、蛋白质、mRNA、miRNA和细胞器，可通过改变基因调控网络和（或）表观遗传程序参与调控机体正常生理功能和异常病理进程，在细胞凋亡、免疫调控、肿瘤迁移、病毒扩散等方面起重要作用。

　　目前，MVs作为一种新型的细胞间信号转导载体，正逐渐引起学者们关注。现对MVs的生物学特征，干细胞来源MVs在再生医学中的应用研究进展、未来发展方向和挑战综述如下。

　　1 MVs的生物学特征

　　1.1 MVs的形成和释放

　　MVs是从细胞表面脱落或分泌的小圆球形膜样结构，在血液和其它体液中可检测到两种类型MVs,即外核体（exosomes）和脱落囊泡（sheddingvesicles）[1].两者之间没有严格的鉴别标准，主要差异为囊泡产生的方式和生理生化特征。外核体是指大小比较均一，约30~120nm的双层膜小囊泡，来自于细胞内涵体膜区室，由微泡体外膜和细胞膜融合后释放到胞外环境或体液中，此过程依赖于细胞骨架激活的胞外分泌，具体机制不清楚，机体内多种细胞均能分泌外核体，在活化状态下细胞分泌显着增加。分泌的外核体可被周边细胞，或通过血液循环及其它体液被远处组织细胞摄取利用[2].在细胞内，高尔基体运输可溶性因子到细胞表面过程中同时伴有外核体的释放。因此，体外培养细胞的培养基中往往同时含有可溶性因子和MVs.

　　脱落囊泡，也称之为microparticles,直径通常在100~1 000nm之间，成分中含有与母细胞膜相似的脂类和蛋白，也可能包含胞质中细胞器和部分mRNA.脱落囊泡产生过程与胞质内钙离子浓度的增加和细胞骨架的重构有关，钙离子通过激活胞质内蛋白酶影响细胞骨架结构，钙蛋白酶和凝溶胶蛋白裂解骨架蛋白的网状结构，造成细胞骨架破坏，使细胞膜以“出苞”方式释放囊泡[3].MVs的脱落是一种生理现象，伴随着细胞的活化和生长。有趣的是，与缓慢生长细胞相比，快速增殖细胞倾向于分泌更多的MVs.

　　1.2 MVs介导的细胞间信息交流机制

　　研究表明，MVs含有母细胞来源蛋白（如信号蛋白、转 录 调 控 因 子、逆 转 录 酶 和 跨 膜 蛋 白 等）、RNA（mRNA、非 编 码mRNA）和DNA（基 因 组DNA和互补DNA），以及完整的细胞器如线粒体等[4].MVs可通过不同的机制调节靶细胞功能：

　　①MVs表达表面分子，通过表面携带的配体与靶细胞受体结合，作为信号复合物直接激活靶细胞。

　　②MVs通过细胞膜融合转导受体和/或生物活性脂质进入靶细胞，或通过细胞吞噬作用摄取MVs内含物，使靶细胞呈现相关受体表型及调控靶细胞功能。

　　③MVs可横向转移遗传信息，MVs在形成过程中可将母细胞质中的成分（多肽或mRNA）一起包裹，传递到靶细胞，使其具有新的生物学功能或遗传特征。另外，MVs还可作为载体转移传染性因子或完整的细胞器，在特定情况下，MVs能以载体形式将病毒 （如HIV或朊病毒）传递给其它细胞并影响靶细胞内信号转导通路[3].某些因素刺激可增加细胞释放MVs,例如：细胞活化，低氧或辐射，氧化损伤，暴露于活化的补体级联反应蛋白中等[5].

　　2 干细胞来源

　　MVs再生医学领域研究进展间 充 质 干 细 胞 （mesenchymal stem cells,MSCs）具备多向分化潜能，能迁移至组织损伤部位，可作为理想的种子细胞应用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。目前MSCs移植已在骨组织损伤、心肌梗死、肾、肺、脑、肝损伤（如毒性药物、缺血再灌注损伤）中广泛开展应用[6],但也存在一些问题，如干细胞在组织损伤部位存活率低，分化潜能有限等。因此，有学者对MSCs的可塑性及转分化作用提出了质疑，认为移植的MSCs在组织损伤部位的积极作用主要与MSCs的旁分泌效应有关，因为MSCs可分泌一些可溶性生物活性因子，能够抑制细胞凋亡和纤维化，促进血管再生和刺激组织内在祖细胞有丝分裂和/或分化，并调节免疫反应促进损伤组织修复再生[7-8].除可溶性因子外，MSCs亦可分泌MVs,且越来越多的证据表明，MVs在组织损伤器官功能恢复过程中可能起到了重要的或被低估的作用。不同来源干细胞，如造血干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、神经干细胞和心肌干细胞等释放的MVs在不同的实验模型中，均能有效地抑制损伤组织细胞凋亡，刺激其增殖和促进微血管再生[9-11].

　　因此，开发利用干细胞来源MVs应用于组织再生和修复治疗，将是一种有效的替代干细胞的治疗策略。

　　2.1 MSCs来源

　　MVs与心肌组织损伤修复2007年Timmers等[12]通过猪和小鼠心肌缺血再灌注损伤模型，发现再灌注前经静脉给予人胚胎干细胞分化的MSCs条件培养基能显着减少心肌梗塞面积，起到心脏保护作用，认为MSCs分泌的保护性外核体在其中发挥主要作用。考虑到胚胎干细胞应用的局限性和生成MVs需要大量细胞，费用较高，该课题组采用Myc永生化胚胎干细胞分化的MSCs来源MVs（MSCs-MVs），结果显示这些细胞来源MVs同样具有心脏保护功能[13].随后进一步发现MSCs来源的外核体能够对心肌缺血提供保护，其机制与MVs转移miRNAs has-let-7b和has-let-7g有关[14].Yu等[15]

　　研究发现，转导GATA-4基因的MSCs-MVs内存在抗凋亡miR-221的高表达，且能被心肌细胞快速内化，起到心肌保护作用。

　　2.2 MSCs来源

　　MVs与肾脏组织损伤修复2009年Bruno等[16]报道，人骨髓MSCs-MVs在肾脏组织损伤修复过程中可起到与MSCs移植相似的作用，在体外实验和甘油诱导的严重联合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency,SCID）小鼠急性肾损伤模型中均能促进肾小管上皮细胞增殖，且 效 应 为RNA依 赖 性，通 过RNase预 处 理MVs,保护效应随即消失，提示保护效应与MVs传递的mRNA有关。进一步分析揭示MSCs-MVs可转移与间充质表型、转录控制、增殖和免疫调控等相关的特定mRNAs,这些mRNA随后在损伤组织细胞内翻译成蛋白，与可溶性因子一起增强MSCs的治疗效应。

　　Collino等[17]在体外和体内实验中也证实MVs可有效转移特定的miRNAs和mRNAs,并在受体细胞内翻译成相关蛋白。随后，该课题组在顺铂诱导的SCID鼠急性致死性肾损伤实验中发现，一次给予人MSCs-MVs能够改善肾脏组织形态的结构和功能，增加存活小鼠数，但不能阻止肾小管慢性持续损伤；而多次给予MVs后，小鼠死亡数进一步减少，21d后存活小鼠显示正常的肾脏组织结构和功能，其机制与MVs诱导的肾小管上皮细胞抗凋亡基因 （Bcl-xL、Bcl2等）的上调 和促 凋亡 基因（Casp1、Casp8和淋巴毒素-α）下调有关[18].此外，MSCs-MVs对肾脏缺血再灌注损伤[11]和残余肾模型中肾损伤[19]均有一定的保护作用。

　　另外，Zhu等[9]报道人MSCs-MVs能够转移角化 细 胞 生 长 因 子 （keratinocyte growth factor,KGF）mRNA到损伤肺泡内表达，对大肠杆菌内毒素诱导的急性肺损伤具有治疗作用。

　　2.3其它干细胞来源

　　MVs与组织损伤修复2010年Herrera等[20]研究发现，在切除70%肝实质的大鼠模型中，注入人肝脏干细胞来源MVs穿梭mRNA（MV-shuttled mRNA），可加速肝脏形态和功能恢复。

　　MVs与肝细胞体外共培养显示，人肝脏干细胞来源MVs可刺激人和大鼠肝脏细胞增殖并抑制细胞凋亡。

　　此外，内皮祖细胞来源MVs可促进组织再生和血管形成。

　　2012年，Ranghino等[21]报道内皮祖细胞来源MVs在SCID鼠后肢缺血模型中可促进新生血管形成和组织再生。Cantaluppi等[22]报道内皮祖细胞来源MVs通过转移促血管生成miRNAsmiR-126和miR-296,可重编程残存肾脏组织细胞，对肾脏缺血-再灌注损伤起到保护作用。并且这种MVs转移的miR-126和miR-296在体外也可促进胰岛血管再生，诱导胰岛内皮细胞增殖，迁移和抑制细胞凋 亡，其 机 制 与MVs诱 导 的 胰 岛 内 皮 细 胞PI3K-Akt和eNOS信号转导途径的激活有关[23].

　　人肾脏干/祖细胞对肾小管内皮细胞的修复作用是通过TLR2受体（Toll-like receptor 2）完成的，其中MVs转移的抑制素A（inhibin-A）和微泡穿梭核心蛋白聚糖（MVs-shuttled decorin）在细胞修复过程中起至关重要的作用[24].此外，肾外干细胞通过分泌生长因子，转移MVs和免疫调节作用，均有助于肾脏组织损伤修复[25].

　　胚胎干细胞来源MVs可诱导视网膜Müller细胞内与多能性、细胞增殖和早期视觉相关基因上调，这些基因与视网膜的保护和重塑相关，并可下调瘢痕相关基因、参与分化和细胞周期阻滞miRNA[26].

　　2.4干细胞来源

　　MVs介导组织损伤修复机制MVs内生物活性成分依赖于来源细胞。通过微阵列比较骨髓和肝MSCs及它们释放的MVs内miRNA图谱，发现部分miRNAs同时存在于MVs和来源细胞内，部分miRNAs选择性存在于MVs,部分miRNAs仅存在于母细胞内，认为MSCs-MVs存在控制miRNAs的分选机制，由于没有精确的定量分析和功能实验，这些结果间的相关性尚不清楚。

　　但当靶细胞缺乏某些miRNAs时，通过MVs选择性转移这些miRNAs或许有特殊作用[17].通过基因芯片分析显示，在MSCs和MSCs-MVs中同时存在的miRNAs,主要与生长发育、细胞存活和分化作用相关，而一些在MSCs-MVs内富含的miRNAs主要与免疫细胞调控有关[27].除遗传物质外，MVs内蛋白的作用也同等重要。

　　Kim等 首 次 应 用 蛋 白 质 谱 分 析 骨 髓MSCs-MVs,730种 蛋 白，功 能 分 析 显 示MSCs-MVs内不仅含有与细胞增殖、粘附、迁移和形态变化等细胞进程相关的蛋白，而且含有大量表面受体（如PDGFRB、EGFR和PLAUR）、信号通路分子（如RAS-MAPK、RHO和CDC42等）以及细胞黏附分子和MSCs抗原，这些分子可能与MSCs-MVs的生物学效应有关[28].因此，干细胞来源MVs介导的修复作用可能与以下因素有关：①MVs富含生物活性脂质；②MVs膜表面 含 有 抗 凋 亡 和 刺 激 生 长 的 细 胞 因 子，如VEGF、SCF;③MVs可通过转移mRNA、调控miR-NA和蛋白提高整个细胞功能。在组织损伤环境中，MVs介导的遗传信息转移一方面可诱导干细胞分化为组织细胞，另一方面，从干细胞来源MVs可诱导组织细胞去分化，重新进入细胞周期分化为邻近损伤组织的细胞类型刺激组织再生，其中MVs介导的mRNA和miRNA转移可影响靶细胞表型和生物学特征[29].

　　3 问题与展望

　　基于MVs在再生医学领域具有与来源细胞相似的有益作用，有可能通过大规模生产MVs,或修饰其结构来达到更好的治疗效应。如通过控制细胞培养条件刺激细胞释放更多的MVs,通过遗传修饰来源细胞定制更适合治疗目的MVs.其次，以MVs为基础的治疗将为诱导性多潜能干细胞（inducedpluripotent stem cells,iPSCs）的临床应用开辟新的途径，由于iPSCs形成畸胎瘤的高风险性限制了其在体内的应用，但如果将病人来源iPSCs产生的MVs应用于组织再生治疗，可大大降低这种风险。

　　再次，外核体是由天然非合成的非病毒成分组成，体积小，易穿透生物膜，使其更容易被递送到靶细胞，并且双层脂质结构可防止内部RNA和蛋白质降解，是一种理想的潜在基因治疗载体。

　　2011年Al-varez-Erviti等[30]首次报道应用修饰后小鼠外核体递送外源性遗传物质（siRNA），成功地促使脑组织特定基因沉默。将这种外核体注射到健康小鼠体内，没有出现不良免疫反应，提示这是一种相对安全的治疗模式。

　　虽然众 多 研 究 结 果 表 明 未 修 饰 的 和 修 饰 的MVs具有治疗相关性，是一种潜在的、有吸引力的治疗手段和研究方向。然而，MVs的应用研究领域仍然有几个基本问题需要解决。例如，获取大量MVs的方法和操作的可重复性，不同来源MVs效力标准的 确 定 等。尽 管 动 物 实 验 初 步 研 究 显 示MVs的给予是安全的，但仍需相关实验调查其长期的安全性。此外，在临床应用之前，MVs的生物分布和持续生物效应，安全应用领域范围和有效剂量等还需要进一步研究。

　　综上所述，干细胞MVs可模拟干细胞的积极作用，是一种潜在的可供选择的治疗组织损伤的方法。MVs通过转移生物活性脂质、蛋白、mRNA和miR-NA到靶细胞，可影响细胞的表型和功能，有助于组织再生和 修 复。从 干 细 胞 培 养 基 中 大 规 模 提 取MVs,通过基因功能改造定制特定功能MVs将更有助于组织损伤的再生治疗。未来仍需进行多方面研究，更好地理解MVs的生物学特性和功能。