人体解剖学论文
据世界卫生组织报道，21世纪男性不育将会是危害人类健康的最严重疾病之一，男性不育因素占不孕不育的40%,且影响男性生育力的危险因素仍在增加[1].抑制素B（INH-B）的检测在男性不育症的诊治中已逐渐得到广泛的应用[2].研究表明，INH-B是一类糖蛋白激素，因可抑制卵泡刺激素（FSH）分泌而得名。男性体内INH的重要生理活性形式为INH-B,其组装过程大部分在生精细胞内完成，然后释放到循环系统和精液中[3-4].女性卵泡液中INH-B的含量为几十ng/ml至几百ng/ml,比血液及精液中的含量高约103倍[5-6].而对于人卵泡液及精液中INH-B的相关研究屈指可数[7],并且对于其存在形式和理化性质并没有确切的研究结果。究其原因主要是由于卵泡液及精液中蛋白种类繁多，不容易从中纯化出INH-B,并且收集大量样品有一定的困难。本实验拟通过对女性卵泡液中INH-B的分离纯化方法及其在卵泡液中分子存在形式的研究，为进一步研究INH-B在临床诊断中的作用打下一定基础。
材料与方法
一、研究对象
1.卵泡液样本：取自北京市家圆医院正常女性卵泡液，共25例，均为育龄期女性成熟卵泡。所有样本均经家圆医院伦理委员会批准，征得志愿者和患者知情同意。
2.主要试剂：两性电解质（Sigma,美国），考马斯亮蓝R-250（Sigma,美国），牛血清白蛋白（BSA）（Sigma,美国），Inhibin B Gen II ELISA kit（Beck-man,美国），聚乙二醇-20 000（PEG-20 000）（西胧化工），乙腈、丙酮、乙醇（北京试剂厂）。
3.主要仪器：聚丙酰胺凝胶电泳仪、电转仪、Rotofor System（BIO-RAD,美国），凝胶成像扫描分析仪 （北 京 君 意 东 方 电 泳 设 备），二 乙 基 氨 乙 基（DEAE）阴离子交换柱（Pharmacia,美国），紫外分光光度计（Thermo Fisher,美国）。
二、研究方法
1.Bradford法测总蛋白质浓度：将标准BSA配制成1mg/ml,分别取0、2、4、6、8、10、12、14和16μl加入到96孔酶标板中，每个浓度重复2次，并以去离子水补至终体积20μl,再加入280μl Bradford工作液，充分混匀，在570nm紫外波长处测定OD值，利用Excel软件计算OD平均值并绘制出标准曲线。当相关系数R2≥0.98时认为两者间存在线性关系。将待测样品1μl加入酶标板中，去离子水补至终体积20μl,加入280μl Bradford工作液，同一样品重复3次。测OD570nm值，取3次平均值后根据标准曲线计算样品蛋白浓度。
2.去除卵泡液中的高丰度蛋白[8]:解冻-20℃保存的卵泡液，4℃12 000r/min离心15min,分别取上清10ml,分别与1.2倍体积的乙腈、丙酮、乙醇混合，立即震荡混匀5min,然后3 000r/min离心15min,取上清，弃沉淀。将上清置于风扇下，挥发至体积10ml.再向各管中加入4倍体积的冷丙酮，-20℃静置1h,至蛋白沉淀完全，3 000r/min离心15min,弃上清，留沉淀。室温放置至丙酮完全挥发，用2ml双蒸水（ddH2O）溶解沉淀。
3.聚丙烯酰胺凝胶电泳：取样品20μl,加入上样缓冲液，沸水浴5min使蛋白变性。电泳条件：60V恒压，样品至浓缩胶与分离胶界限，约30min,150V恒压至溴芬兰到达凝胶底部，约1h.
4.凝胶染色和脱色：使用新配制的考马斯亮蓝R-250染色，室温1h.再用新配的脱色液脱色完全，用ddH2O漂洗，并用ddH2O浸泡保存。
5.DEAE-Sephadex A-50柱层析纯化方法[9]:DEAE-Sephadex A-50经预处理、装柱、平衡、上样、洗脱后收集样品，再用紫外分光光度计分别测定每管OD280nm值，并以OD280nm为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。合并、浓缩：将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG-20000洗缩至适当体积，于4℃保存备用。
6.蛋白质等电点分离法（Rotofor System）：取上述纯化的样品20ml,加入2ml两性电解质混匀，再补水稀释至50ml,并全部注入Rotofor System样品槽中，加水补齐至样品槽中无气泡。恒功率12W（电压为400~500V,电流20~30mA），启动后4.5h共收集20样品。
用pH计分别测上述收集的20管样品的pH值，酸性样品用0.1mol/L pH 9.5的Tris-HCl调pH至中性；碱性样品用稀释10倍的HCl调pH至中性。
7.INH-B蛋白含量测定：按照Inhibin B Gen IIELISA kit的操作说明，完成测定。将待测样品与酶标孔表面的抗体起反应，用洗涤的方法使酶标孔上形成抗原抗体复合物并与样品中其他物质分开。
再分别加入一抗和酶标记的二抗，通过抗原抗体反应结合在酶标孔上。加入酶反应底物后，生成有色产物，用酶标仪测450nm吸光值。