活性氧调控免疫应答的作用及机制

　　活性氧（ Reactive oxygen species,ROS） 是一群具有较强氧化能力的分子的总称[1].生物体内的ROS 包括超氧阴离子（ O2· -） 、羟自由基（ ·OH） 、过氧化氢（ H2O2） 、单线态氧（ O2） .活性氧在免疫系统中主要来源于细胞膜的 NADPH 氧化酶复合体2 （ Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxi-dase,NOX2） ,并在淋巴细胞间的信号转导发挥巨大作用[2].早在 1980 年人们就认识到 ROS 在固有免疫中作为主要武器对抗病原体的重要作用，现今发现其在不同浓度的情况下在获得性免疫中的重要调节作用。

　　1 ROS 的功能

　　之前的观点认为 ROS 是一类细胞内毒性物质，到后来从被证明可以激活胞浆内的第二信使鸟苷酸环化酶（ cGMP） 开始，ROS 在细胞信号转导中发挥的作用越来越受到人们的重视。O2· -是线粒体产生 ROS 的前体，其他形式都是由生物体内各种酶催化 O2· -而来。其中超氧岐化酶（ SOD） 可以催化O2· -转化为 H2O2.H2O2是 ROS 中最稳定的形式且扩散能力较强，但是据资料显示它的稳定会受到细胞内的 pH 和氧化还原平衡影响[3].H2O2的强扩散力主要因为它可以自由进出细胞膜，而最近证据表明： 过氧化氢可能通过细胞水通道蛋白优先进入特定的细胞[4].H2O2主要通过氧化多种蛋白质的半胱氨酸残基（ -SH） 来实现信号转导。它具有靶向可逆的氧化半胱氨酸的硫化物（ -SH） 为次磺酸（ -SOH） .带电的氨基酸可以使正常的半胱氨酸残基 pKa8. 5 降低到 pKa5 以下，这种低 pKa 半胱氨酸可以成为 H2O2的氧化目标。这个发现支持过氧化氢可以作为第二信使[13,14].H2O2可以以模仿配体的方式来激活多种受体信号通路。它可以直接激活部分受体或者激活含有蛋白质酪氨酸激酶（ PTKs） 的通路。另一个通路是抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶（ PTPs） 的激活。PTP 主要在受体激活通路的信号传递中起抑制作用并且抑制 PTK 的活化。一些像染色体的张力蛋白（ PTEN）和促分裂原活化激酶（ MAPK） 之类的磷酸酶也可以被 H2O2所抑制[5].

　　2 免疫应答中 ROS 的来源

　　在有氧呼吸过程中，多数真核细胞都可产生ROS 参与细胞间的转导。线粒体内膜上的电子传递链是细胞内 ROS 产生的主要部位。在线粒体内膜呼吸链的 5 个复合物中，小部分电子由复合物Ⅰ、复合物Ⅲ漏出，使分子氧还原生成 O2· -.免疫系统中吞噬细胞是最早发现可以产生 ROS,随着检验探测技术的发展，研究者用胞内荧光探针如二氯荧光黄双乙酸盐（ DCFH-DA） 、二氢乙啶（ DHE） 、双氢罗丹明（ DHR） 等，通过流式细胞分析仪检测单个细胞合成的 ROS 已经证明 T、B 淋巴细胞也能产生 ROS.特别是 T 细胞受体 TCR 活化后的 2 ~ 4 min 就有ROS 产生，这提示 ROS 是 TCR 活化的过程中的潜在作用分子[6].淋巴细胞主要通过细胞质膜上 NADPH 氧化酶复合体 2 产生，而 NADPH 氧化酶复合体 2 缺陷的小鼠 T 细胞 ROS 产生减少并且该小鼠获得慢性肉芽肿性病（ Chronic granulomatous disease,CGD） ,充分说明 NADPH 氧化酶复合体 2 是免疫系统产生ROS 的重要来源[7].

　　3 活性氧调控免疫应答的作用及机制

　　3. 1 活性氧在先天免疫中的作用 早在 1980s 人们就认识到中性粒细胞在病原体入侵机体时可以产生大量的 ROS 来消灭病原体。ROS 在先天免疫应答中不仅对病原体有直接杀伤作用，还可以通过调节 NK 细胞活性来参与一系列抗菌活动。

　　3. 1. 1 活性氧的抗菌作用 机体遭遇病原体入侵时，中性粒细胞、吞噬细胞“呼吸爆发”产生大量的ROS.由此产生的 ROS 为抵抗病原体的主要武器。缺乏 NADPH 氧化酶复合体 2 的患者先天免疫低下而易患各种感染。虽然 NADPH 氧化酶复合体 2 主要产生超氧化物，但因为其相对于其他形态 ROS 的不活跃性，因此对超氧化物直接杀伤病原体的能力仍然存在争议[2].反而由于其自身的不稳定性，超氧化物会转化成其他更稳定的形式。在超氧岐化酶的催化下超氧化物歧化成 H2O2,而 H2O2可以氧化靶蛋白的半胱氨酸残基或形成二硫化物达到杀伤病原体的目的。H2O2和氯离子 Cl-在髓过氧化物酶的作用下产生次氯酸（ HOCl） .HOCl 和 H2O2可以在局部聚集一定的浓度产生杀菌作用。

　　然而，最近的研究结果表明，ROS 不仅直接用于杀死病原体，还动员其他抗菌策略。中性粒细胞是人体最多的免疫细胞，它是人体免疫的第一道防线，甚至细胞死亡后可以形成中性粒细胞胞外网状陷阱（ NETs） .NETs 包括 DNA /组蛋白骨干和抗菌素肽。这些网状结构可以阻止病菌的扩散，而且来自中性粒细胞颗粒的抗菌蛋白具有杀菌作用。但是有 NADPH 氧化酶复合体 2 缺陷的病人则不能形成这种陷阱说明来源 NADPH 氧化酶复合体 2 的 ROS在这一杀菌机制中有重要的作用[8].

　　3. 1. 2 活性氧调节自然杀伤细胞的活性 不需要与抗原接触，NK 细胞是先天免疫系统的主要作用细胞能杀伤恶性细胞和已感染的细胞，并且 NK 细胞通过大量的细胞毒素对癌症起到免疫监视作用。1980 年的研究揭示了 NK 细胞遇到癌细胞早期会促进 ROS 的产生并且这对 NK 细胞介导的细胞溶解是必需的。来自慢性肉芽肿性病患者的 NK 细胞在缺乏 NADPH 氧化酶复合体 2 的情况下，仍拥有正常的溶解功能，随后实验证明可能来自脂氧合酶途径[6].

　　有数据证明单核细胞可以抑制 NK 细胞的活化、增殖、IFN-γ 分泌和细胞毒性。而来自慢性肉芽肿性病患者的单核细胞却不抑制 NK 细胞功能，表明 NADPH 氧化酶复合体 2 产生的 ROS 在此抑制中的主要作用因子[6].组胺与 H2 受体结合可产生解除单核细胞抑制 NK 细胞的作用，而单核细胞自身可以抑制组胺的产生。IL-12 最初可以激活 NK 细胞，但延长 IL-12 的作用会诱导 NK 细胞的凋亡，并降低 NK 细胞的细胞毒性和 IFN-γ 的分泌。数据表明延长 IL-12 的刺激作用会导致 ROS 的聚集，进而使细胞释放细胞色素 c,而高浓度的 ROS 会抑制 NK细胞的细胞毒性并且诱导凋亡。

　　3. 2 活性氧在获得性免疫中作用 ROS 不仅是先天免疫的主要武器，而且从影响抗原提呈细胞的成熟分化到调节 T、B 细胞的活化、增殖、凋亡来调节获得性免疫。有数据显示提高胸腺细胞内的 ROS浓度会影响正常 T 细胞的发育而损害哺乳动物的获得性免疫系统[15].

　　3. 2. 1 活性氧对抗原提呈细胞的作用 树突状细

　　胞（ Dendritic cell,DC） 是体内最主要的抗原提呈细胞，可以启动一系列免疫反应。在体内，当受到外源病原体的刺激时，DCs 捕获大量的抗原并且把它们提呈给 T 细胞去引发抗原特异性免疫应答。当获得功能性成熟型表型 DCs 将下调他们抗原捕获能力而上调抗原提呈能力和协同刺激分子的表达。

　　H2O2可以上调 DC 的 HLA-DQ、DR 分子和协同刺激分子 CD40 和 CD86 的表达，同时下调 CD32 和CD1α 来诱导 DC 的表型和功能成熟，降低 DC 的抗原捕获能力促进抗原呈递作用[9].有实验用蛋白水解酶阻断 MG-132 预处理 DCs,该物质可以阻断NF-κB 活性，结果 H2O2对处理后的 DCs 诱导其CD86 上调的作用大大减弱。数据表明 H2O2可以通过 NF-κB 机制来诱导 DCs 的表型和功能的成熟。

　　同时发现经过 H2O2处理后的 DCs 比正常的 DCs 更能诱导 T 细胞的增殖，该作用可被自由基清除剂 N-乙酰半胱氨酸 NAC 所抑制。相反，有结果也显示： 膀胱癌患者中的 ROS 可能下调 DC 呈递肿瘤抗原给 CTL 从而抑制 CTL 对膀胱癌 T-24 的杀伤能力，并且这种抑制作用随浓度的降低逐渐减弱。目前认为正常的机体处于氧化还原的平衡状态，机体本身有强大的代偿作用。当机体产生 ROS时同时也会产生抗氧化物质。当机体处于急性或慢性炎症时氧化平衡点可能不同而 ROS 会显示不同的作用。

　　3. 2. 2 活性氧对淋巴细胞的作用

　　3. 2. 2. 1 活性氧激活淋巴细胞 现在已明确 ROS特别是 H2O2能作为第二信使参与淋巴细胞的活化。ROS 能激活 JNK-1 通路从而引起 IL-2 的表达，而 IL-2 是作为 T 淋巴细胞活化的第三信号[6].早期抑制 NADPH 氧化酶复合体 2 来阻断该来源的ROS 产生会抑制淋巴细胞的活化[20].T 细胞在识别抗原和活化过程中需要和 APC通过免疫突触紧密接触。NADPH 氧化酶复合体 2是 APCs 膜的组成成分，并且由脂筏运输到免疫突触，在免疫突触这局部微环境内 O2· -歧化的 H2O2可以聚集足够的浓度来氧化半胱氨酸，从而激发 T细胞活化通路[17].

　　蛋白酪氨酸激酶（ PTK） 和蛋白酪氨酸磷酸酶（ PTP） 是淋巴细胞活化和失活的两大对立的含有半胱氨酸的酶系统，也是 ROS 的主要作用靶点。在抗原和病原体的刺激下，静息状态下的 B 细胞活化生成浆细胞并产生抗体。有实验证明用过矾酸钠（ PTP 的抑制剂） 取代抗原与 B 细胞孵育，B 细胞会产生更多的抗体。Igα 和 Igβ 尾端都带有一个含有酪氨酸激活基序（ ITAM） .静息状态下 ITAM 被活性 PTP 抑制而在 BCR 的活化中产生的 ROS 可以抑制 PTP 从而解除对 ITAM 的抑制[11].有 3 个 PTK（ Lyn、Syk 和 Btk） 和一个 PTP（ SHP-1） 参与 BCR 的信号转导。双磷酸化的 ITAM 允许带有 SH2 氨基末端的 Syk 和 BCR 相连，这刺激更多的 Syk 激活和产生。SHP-1 则可以抑制 Syk 的活性。

　　更有实验证明，ROS 可以通过氧化 PTP 的半胱氨酸残基使之失活从而解除 PTP 对 ITAM 的抑制，ITAM 活化后可以激活 Syk,Syk 又可以刺激更多的ROS 产生从而放大刺激 BCR 的活化。而在 T 细胞内，ROS 特别是 H2O2抑制 PTP 可以促进细胞内MAPK 的磷酸化来促进 T 细胞的活化[12,14].

　　3. 2. 2. 2 活性氧与淋巴细胞分化、增殖和信号转导实验表明淋巴细胞的分化和增殖伴随着 ROS 浓度的增加。体外用分裂素刺激 B 淋巴细胞实验中，最初 2 h ROS 的浓度仅轻度增加，而 24 h 后则增加明显，伴随着抗氧化物质的明显增加[19].ROS 可以直接或间接作用于多种转录因子如：p53、jun、Akt 等参与调控 MAPK 和 NF-κB 等信号通路来介导淋巴细胞分化、增殖和信号转导。MAPKs对氧化还原特别敏感并且与细胞的增殖、分化、凋亡密切相关。该信号系统主要包括细胞外信号调节激酶（ ERK） 、c-JunN 端激酶 JNK 和 P38MAPK 三条途径。通常 ERK 主要接受生长因子的刺激，活化后激活转录因子活化蛋白-1（ AP-1） 来介导细胞增殖和分化。而 JNK 和 P38MAPK 激酶介导细胞凋亡[11].

　　NF-κB 是最早发现的与细胞氧化还原状态密切相关的转录因子。NF-κB 由 P50、P65 和抑制亚基 I-κB组成。I-κB 的磷酸化后被蛋白缀合酶降解，NF-κB活化入核从而发挥其作用。ROS 通过增强蛋白缀合酶的活性来促进 I-κB 的降解进而增强 NF-κB 的活化。

　　3. 2. 2. 3 活性氧与淋巴细胞凋亡 ROS 不仅可以促进淋巴细胞的活化和增殖，还可以调节淋巴细胞的凋亡。在免疫应答晚期，仅小部分的 T 细胞转变成记忆细胞而存活，大部分的 T 细胞发生凋亡来维持机体内环境的稳定。淋巴细胞的凋亡可分为活化诱导的细胞凋亡（ AICD） ,及活化 T 细胞的自发死亡（ ACAD） .ROS 主要通过调控 Fas（ CD95） 的表达来调节 AICD.当 T 细胞处于静息状态 CD95 处于低水平，当 T 细胞活化后 ROS 通过调控 NF-AT、NF-κB转录因子来上调 CD95 的表达[7].当 Fas 与相应配体 FasL（ CD95L） 结合后，Fas 受体三聚化而活化，激活的受体与 FADD 结合，与 Caspase-8 相互作用使后者激活，形成死亡诱导信号复合物，再激活一系列的 Caspase-1,3,7 等，促进 Fas 蛋白所在细胞的凋亡发生[11].

　　ACAD 又称受体饥饿性细胞凋亡或者线粒体途径凋亡。其中 Bcl-2 家族是 ACAD 的主要作用因子。其中抗细胞凋亡的 Bcl-2 家族成员的表达水平对细胞存活起决定性作用[18].ROS 通过下调抗细胞凋亡的 Bcl-2（ BH-3 only） 分子来增加线粒体膜的通透性，增加线粒体通透性转运孔道（ MPTP） 开放。

　　ROS 可氧化通透性转换蛋白来影响线粒体的阴离子通道。当线粒体暴露于 H2O2,线粒体膜电位下降，细胞色素 C 释放。而细胞色素 C 的释放又会导致更多的 ROS 产生，这样的正反馈放大过程加速细胞的凋亡。ASK1 是 JNK 的上游激酶，生理情况下ASK1 处于相对还原的状态。ROS 的增加可以使ASK1 得酶活性恢复，激活下游的 JNK 途径[4],并且ROS 可以直接通过抑制 GSTp 的磷酸化使其与 JNK分离来恢复 JNK 的活性促进细胞的凋亡。不难发现 ROS 调节淋巴细胞作用存在浓度差异，低浓度的增高产生正性信号有助于淋巴细胞的活化、增殖、分化； 而高浓度的增高则产生负性信号，促进淋巴细胞的凋亡。

　　4 结语

　　随着我们对 ROS 了解的不断深入，ROS 从无足轻重的氧化呼吸副产品转变成细胞间信号转导的重要成分。甚至在机体免疫中也发挥着不可忽视的作用，在先天免疫中不仅是主要杀伤病原体的武器还可以调节自然杀伤细胞的活性； 而在获得性免疫，低浓度的 ROS 可以刺激淋巴细胞活化、增殖、分化，促进免疫激活； 而在高浓度的 ROS 刺激下淋巴细胞趋于凋亡，促进免疫终结。现有多种疾病如肿瘤、哮喘、血液病、类风湿等发病机制都与免疫有关。弄清楚 ROS 对免疫系统的具体作用机制能为这些免疫相关的疾病提供新的治疗思路。

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