HPIV-3的病毒学特点与预防性免疫(2)

　　在 HPIV 的 4 个血清型中，HPIV-3 感染最为常见，因此更多学者致力于 HPIV-3 疫苗的研制工作。

　　婴幼儿是 HPIV-3 感染的主要易感人群，且感染常发生在出生后的前几个月。由于婴幼儿免疫系统发育不完善，抗体应答能力较弱、持续时间较短，因此易发生反复感染。这就要求一个好的 HPIV-3 疫苗不仅可以在婴幼儿体内引发有效的黏膜及血清抗体保护性免疫应答，而且还必须在幼儿体内具有良好的安全性。在几十年的不懈努力下，对 HPIV-3 减毒活疫苗的研究已逐渐成熟，许多候选疫苗进入了全面临床评估阶段，为后续进一步的临床试验积累了大量数据。近年来，随着分子生物学及反向遗传学技术的发展，国内外研究人员在先前疫苗研究的基础上，尝试开展了一系列 HPIV-3 新型疫苗的研制工作，也取得了可喜的进展。

　　2. 1 减毒活疫苗
　　
　　最初采用传统的福尔马林灭活的方法研制了 HPIV-3 灭活疫苗，该灭活疫苗与RSV 灭活疫苗相似，由于其在棉鼠体内并不能诱发有效的免疫应答保护，反而伴有疾病增强作用，因而宣告失败[20].此后，科学家们主要致力于 HPIV-3减毒活疫苗的研制工作。

　　2. 1. 1 牛 3 型副流感病毒（ Bovin Parainfluenza Vi-rus type 3,BPIV-3） 减毒活疫苗 BPIV-3 和 HPIV-3在基因构成上有很多相似之处，两种病毒具有 25%的中和抗原相似性，因此 BPIV-3 诱导的免疫应答对HPIV-3 有交叉保护作用[10].由于宿主范围限制作用，相比于 HPIV-3,BPIV-3 在恒河猴呼吸道内的复制能力降低了近 9/10 倍。因此，科学工作者首先仿照牛痘预防天花的策略，将从患病动物体内分离出的 BPIV-3（ Kansas 株） 作为一种减毒活疫苗用于预防 HPIV-3 的感染。

　　Karron 等[21]在 2 ~6 月龄及 6 ~36 月龄的婴幼儿中对该疫苗进行了 I 期临床评估，结果显示，该疫苗在两个年龄段的儿童中都具有良好的适应性； 相比于 2 ~6 月龄的婴幼儿，该疫苗在 6 ~36 月龄的婴幼儿中诱发的抗体应答水平更高； 且在 2 ~6 月龄的婴幼儿中，如其母源性抗体较低反而可诱发更高的抗体应答反应。这可能是由于年龄较大的儿童胸腺发育较为成熟，细胞免疫在促进机体内体液免疫应答的过程中起到一定作用。虽然母源性抗体可保护2 ~ 6 月龄的婴幼儿免受 HPIV-3 感染，但也对 BPIV-3 减毒活疫苗中活病毒的复制起到一定的抑制作用。该项研究证明，BPIV-3 对 6 个月以下的婴儿具有良好的保护其免受 HPIV-3 感染的作用，但对可诱发更高免疫应答的免疫程序还需做进一步研究。

　　Greenberg 等[22]对 BPIV-3 在2 月龄的婴幼儿中所做的 II 期临床试验更进一步证明，其可在该年龄段的婴幼儿体内稳定复制，同时免疫原性良好，但其安全性还需要进一步的临床研究。

　　2. 1. 2 冷适应减毒活疫苗 为了得到 HPIV-3 减毒株，Belshe 等[23]尝试对分离自患有下呼吸道疾病儿童的 HPIV-3 野毒株进行冷传代培养，得到了冷适应株 HPIV3 cp45.在 HPIV-3 野毒株冷适应连续传代的过程中，其温度敏感性日益增加、毒性逐步降低。同时发现，所有具有温度敏感性突变的毒株都同时具有冷适应特性，但具有冷适应特性的毒株不都具有温度敏感性表型。这提示，冷适应株的温度敏感性表型可能由于某些基因突变引起[24].（ 据文献[25]报道，这可能是由于 L 蛋白中三个氨基酸突变引起） ,且这种基因水平的突变具有遗传稳定性。因此这种既具有减毒表型又具有温度敏感性的冷适应株 HPIV3 cp45 为 HPIV-3 减毒活疫苗的发展奠定了基础。HPIV3 cp45 候选疫苗 I 期和 II 期临床试验结果表明，其在婴幼儿中具有良好的免疫原性和安全性。

　　Belshe 等[26]对 cp45 疫苗做了 II 期临床试验，在 226个 HPIV-3 血清学抗体阴性的 6 ~18 月龄的儿童中，114 人接种 HPIV3 cp45 疫苗、112 人接种安慰剂，接种疫苗后的血清抗体检测结果显示，疫苗组接种者中84% 有 4 倍抗体滴度升高，同时无不良反应。

　　HPIV3 cp45 疫苗在婴儿体内可诱发有效的免疫保护应答，是较有希望的 HPIV-3 疫苗。目前，该疫苗的 III 期临床试验正在进行中。尽管 HPIV3cp45 目前在体内、体外试验中都具有很好的减毒表型，但存在随样本量扩大而不稳定的可能。

　　2. 1. 3 反向遗传学技术制备的减毒活疫苗 反向遗传学技术利用 RNA 病毒基因组或反义基因组的cDNA,拯救出具有感染性的病毒，该技术是目前产生毒力减弱突变以获得减毒活疫苗的重要工具。

　　以 HPIV-3 基因组为骨架的反向遗传学减毒活疫苗利用反向遗传学技术，对 HPIV3 cp45 所有已知的突变位点进行定点突变，得到了对温度更加敏感，同时进一步减毒的重组减毒活疫苗 rHPIV3cp45.Englund 等[27]对 rHPIV3cp45 疫苗在 HPIV-3 血清抗体阴性儿童中的免疫效果做了评价。在这项研究中，40 名 6 ~ 36 月龄的 HPIV-3 血清抗体阴性的儿童被随机分为 2 组（ 约 2∶ 1） ,27 名受试者接种两剂 105TCID50剂量的 rHPIV3cp45、其余受试者接种安慰剂。结果显示，疫苗组在接种一剂疫苗后，rHPIV3cp45 可在约 96% 的婴幼儿体内进行病毒复制； 在 6 个月后的第二剂疫苗接种后，病毒只可在35% 的婴幼儿体内复制。且一剂接种后血清中的抗体滴度明显高于第二剂接种后的抗体滴度，同时不良反应无明显差异。该结果显示，rHPIV3cp45 可在血清学阴性的儿童中诱导抗体应答且减毒充分，同时其具有良好的复制能力、免疫原性和适应性，两剂接种可显着提高机体保护性免疫应答[10].在进一步的临床试验中应优化免疫程序，延长两剂接种的时间间隔，以期激发更高水平的保护性免疫应答。

　　Karron 等[28]的研究进一步显示，rHPIV3cp45 与生物源性的 HPIV3 cp45 具有相似的生物性质。同时 rHPIV3cp45 也可作为疫苗载体，在 HPIV-1 疫苗研制中得到了良好的应用。Madhi 等[29]用野生型 HPIV-1 的 HN 和 F 基因代替 rHPIV3cp45 毒株HN 和 F 基因的阅读框，构建了一种重组的嵌合病毒疫苗。该疫苗不但可保护仓鼠免受 HPIV-1 感染，且由于基因框架替换，相比于 rHPIV3cp45,其毒性进一步减弱。这项研究也为新型人用 HPIV-1 疫苗的发展指明了良好的前景。

　　利用反向遗传学技术以 BPIV-3 具有感染性的cDNA 为骨架，拯救得到了含有重组病毒株 r-BPIV3的减毒活疫苗。r-BPIV3 在体外显示出温度敏感表型，在动物的体内实验中显示出减毒特性。进一步用 HPIV-3 的 HN 及 F 基因替换 BPIV-3 HN 及 F 基因的阅读框架，利用反向遗传学技术构建出的嵌合重组病毒 rB/HPIV-3 在体外也具有温度敏感表型。虽然 rB/HPIV-3 在动物中的减毒程度没有 r-BPIV3强烈，但这两种疫苗都可保护小动物免受野生型HPIV-3 的感染。rB / HPIV3 与 rHPIV3cp45 有相似的减毒特性及复制能力，目前，它在 6 ~36 月龄婴幼儿中的临床试验正在进一步研究中[30].上述数据同时证明 r-BPIV3 因具有宿主范围限制及减毒特性，可将其作为一个病毒载体来表达外源基因，从而研发出更多新型的减毒活疫苗[31].

　　2. 2 亚单位疫苗
　　
　　亚单位疫苗是指由纯化的一种或几种致病病原体的保护性抗原组分组成的不含核酸的非复制型组分疫苗，其含有的保护性抗原成分能诱发良好的免疫应答。亚单位疫苗的主要组分为蛋白质，是一种 T 细胞依赖抗原，但由于婴幼儿的免疫系统发育不完全，其对婴幼儿的保护效力一直受到争议。

　　HPIV-3 的 HN 及 F 蛋白与病毒感染密切相关，并且这两种蛋白含有有效的中和抗原表位，针对这两种蛋白产生的抗体对该病毒具有中和作用，因此 HN和 F 蛋白是 HPIV-3 疫苗研究的主要靶蛋白。为了对疫苗的主要组分有更深入的认识，Haller 等[31]首先将 HPIV-3 的 HN 及 F 基因分别插入删除了 HN 及 F蛋白阅读框的 cDNA 克隆中，构建得到可分别表达HN 及 F 糖蛋白的重组病毒。这两种重组病毒疫苗都对棉鼠具有良好的保护作用。相比之下，表达 HN蛋白的重组病毒疫苗可比表达 F 蛋白的重组病毒疫苗在棉鼠体内诱发更强的免疫保护。

　　Brideau 等[32]将 HPIV-3 HN 蛋白的 N 端及 F 蛋白的 C 端截去（ 截去胞内区，保留胞外区） ,将两种蛋白的胞外区融合成一个嵌合糖蛋白（ FHN） 免疫小鼠，结果显示，100 ng 剂量的 FHN 就可对棉鼠起到完全保护； FHN 上的 T 细胞识别表位可在小鼠体内诱发直接针对 HN 及 F 蛋白的细胞免疫应答，且引发的免疫应答保护效果强于由两种糖蛋白（ HN 或 F） 单个免疫或将两种单个糖蛋白混合后再免疫所产生的保护效果。这可能是由于两个蛋白嵌合后的相对分子质量变大，提高了蛋白的免疫原性与抗原提呈能力； 也可能是由于 FHN 嵌合蛋白可折叠成一个结构更正确的构象，使该蛋白正确裂解成两个亚单位（ 这在 RSV的嵌合糖蛋白 FG 中也得到了证实） .尽管亚单位疫苗在动物试验中取得了良好进展，但其都还处于实验室研究阶段，没有进入临床试验，其在人体特别是婴幼儿中的免疫效力还需要进一步的临床研究来证明。在亚单位疫苗的研制过程中，将保护性抗原成分与新型有效的疫苗佐剂联用，得到可同时激发保护性体液免疫及细胞免疫的新型疫苗，在今后也将是一个重要的研制方向。