浆细胞样树突状细胞的特点及免疫耐受

　　浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells,pDC）可以通过胞质内 TLR 识别病毒 RNA 或细菌非甲基化 DNA,产生大量 1 型干扰素（interferon 1,IFN1），因此最初被称为IFN 产生细胞（ interferon producing cell,IPC），对于机体抗病毒免疫有重要作用，是联系固有免疫和适应性免疫的重要细胞[1].由于其活化过程中能够分化成为经典的 DC 样细胞，活化后具有 DC 的形态，并且提高了 MHCⅡ类分子和共刺激分子表达，增强了诱导初始 CD4+T 细胞增殖的能力，又被称为前体 DC2（precursor DC2,pre DC2）[2].尽管 pDC 与经典的树突状细胞（conventional dendritic cells,cDC）之间存在功能联系，但是 pDC 具有完全不同于 cDC 的表型和功能。同时，pDC 表现出极强的耐受诱导功能，可以诱导 CD8+T 细胞清除，CD4+T 细胞失能和调节性 T 细胞（ regulatory T cell,Treg） 分化[2 -4].研究表明，pDC 表达活化性共刺激因子水平较低，刺激 T 细胞活化的能力较弱，与 cDC 有明显的区别，其共刺激表达谱明显有利于耐受诱导，因此作为诱导免疫耐受的重要细胞类型，越来越受到重视[5].

　　1 pDC 的发生和发育以及表型

　　DC 的发育具有高度的可塑性和复杂性，其细胞来源的不同或者发育所处的不同免疫反应阶段都可能影响其发育。在免疫平衡状态下，除肺部 pDC 半寿期较长之外（可达 25 d），外周器官中的 pDC 半寿期均较短（平均 5 ~7 d），因此在循环和外周的前体细胞有较快的增殖速度和代谢频率[5].与 cDC相似，pDC 也来源于骨髓中的 CD34+前体造血细胞，经过血液循环，定植于胸腺和次级淋巴器官。pDC 与 cDC 源于共同树突状祖细胞 （ common dendritic progenitors,CDP），表达fms 样酪氨酸激酶 3 配体 （ fms-like tyrosine kinase 3 ligand,Flt3-L,CD135）、集落刺激因子 1 受体 （ colony stimulationfactor 1-receptor, CSF1-R , CD115 ） 和低水平的 c-kit（CD117）[1].pDC 的分化依赖 Flt3-L 的刺激信号，该信号可以有效的扩增 cDC/pDC 共同祖细胞，维持外周 DC 平衡，而pDC 的发育需要较高浓度的 FLT3L 刺激并且有 IFN1 信号[6].

　　具有锌指结构的转录调节因子 IKROS 家族对于 DC 发育非常重要，该转录因子基因敲除后可导致 DC 谱系的清除[1].IFN调节因子 4（interferon regulatory factors 4,IRF4）和 IRF8,富嘌呤核酸结合蛋白 1（purine-rich nucleic acid binding protein. 1,PU. 1） 和生长因子非依赖性转录抑制因子 1 （ growth factorindependent transcription repressor 1,Gfi1）等都对总的 DC 发育均具有关键影响[1].Spi-B 高表达于 pDC,参与了 IRF-7 介导的IFN1 分泌，同时发现缺乏 Spi-B 的小鼠淋巴组织中 pDC 数量明显下降，说明 Spi-B 对于 pDC 功能和发育均有重要影响。

　　另有研究发现，Spi-B 是通过作用于抗凋亡的 Bcl-2-A1 基因从而提高 pDC 功能和生存的[7].目前发现特异性的 pDC 谱系是由转录因子 4（transcription factor 4,TCF4,E2-2）决定的，进一步研究证实 E2-2 可以促进其他有利于 pDC 发育的转录因子表达，如 IRF8 或者 Spi-B（仅在淋巴细胞中表达），并抑制 cDC 发育的转录因子如 DNA 结合抑制因子2（inhibitor of DNAbinding 2） 等。因此，E2-2 和 Id-2 之间的平衡决定了 pDC 谱系的分化，E2-2 缺陷小鼠中 pDC 可出现 Id-2 表达提高并向 cDC转化。在成熟的 pDC 中清除 E2-2 也发现 pDC 不能保持原有表型而向 cDC 分化[8].芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor,AhR） 对细胞针对环境刺激或内源性配体的反应具有调节作用，目前在小鼠中发现其对 DC 的活化和发育也有重要影响。

　　AhR 调节 pDC 的发育，阻断 AhR 可以显着减少体外诱导 pDC的 产生，而激活剂有相反作用[9].临床上也发现，AhR参与了 DC 的发育，体外应用其激活剂干细胞再生素 1 （stemregenin 1,SR1），可以诱导造血祖细胞（ hematopoietic progenitorcells,HPC）产生可应用于临床的大量 mDC 和 pDC[10].

　　在 pDC 的表型水平，人类的 pDC 不表达 DC 的表面标志CD11c（小鼠中等表达），而高表达血 DC 抗原 2（blood DCantigens 2,BDCA-2）、免疫球蛋白样转录本 7（immunoglobin-liketranscript 7,ILT-7） 、IL-3Ra（ CD123） 和 BDCA-4,以及 B 细胞标志 CD45RA/B220[11].小鼠高表达骨髓基底细胞抗原 2（bone marrow stromal cell antigen 2,BST-2,CD137）、Ly6C 和Ly49Q 等[11].BDCA-2 仅表达于人类 pDC,参与 pDC 捕获、内化和提呈抗原，利用转基因小鼠研究发现负载抗原，与诱导 Treg 产生密切相关。抗原通过 BDCA-2 传递给 pDC 是诱导免疫耐受的有效手段[12].唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素 H（sialic acid binding Ig-like lectin H,Siglec-H） 介导的抗原传递，目前认为可导致 Th1 细胞、Th17 细胞等抗原特异性的低反应性，而不增加 Foxp3+Treg 或转化为 Th2 细胞以及 1 型调节性 T 细胞（type 1 regulatory T cell,Tr-1）[13].

　　2 pDC 的定位和迁移

　　所有的 DC 亚群均来源于骨髓，通过外周淋巴循环至次级淋巴器官（淋巴结、脾脏），此过程是由高内皮后微静脉系统表达的 L 选择素（非炎症状态时）和 E 选择素（炎症状态时）介导的。与 cDC 定位于外周带但在活化后分散于 T 细胞区有明显区别，在免疫平衡状态下，pDC 主要发现于外周淋巴器官的 T 细胞区域，在活化后形成集落[8].尽管 pDC 与cDC 的趋化因子受体表达谱相对一致，均表达 CXC 趋化因子受体 3[chemokine （C-X-C motif） receptor type 3,CXCR3]和CXCR4、CC 趋化因子受体 1 （ CC chemokine receptor type 1,CCR1） 、CCR2、CCR5 和 CCR7,但是除 CCR7 能够介导 pDC在体外的迁移之外[8],目前认为其多数趋化因子受体是没有功能的，并在 pDC 受到体外刺激时下调。目前认为 CCR9 是负载抗原的 pDC 向胸腺和小肠迁移的标志[14].

　　3 pDC 和免疫耐受

　　目前发现，pDC 具有较强的诱导 Treg 能力，参与多种条件下免疫耐受的诱导和维持。首先，负载抗原的 pDC 从外周归巢至胸腺，诱导自身反应性 T 细胞的克隆清除，并诱导自然调节性 T 细胞（natural Treg,nTreg）产生，参与中心性免疫耐受的诱导和维持。pDC 还参与黏膜免疫耐受的诱导和维持，在诱导消化道的无害抗原和吸入的抗原的黏膜耐受具有不可或缺的作用。肝内定植的 pDC 具有较低的免疫刺激活性，有刺激免疫耐受和免疫调节的作用，可能一定程度上解释了肝脏移植容易产生移植耐受的现象。Peyer 小结（Peyer'spatch） 内 pDC 不能产生 IFN1,而脾脏的 pDC 在受到转化生长因子β（transforming growth factorβ,TGF-β）、前列腺素 E2（prostaglandin E2,PGE2） 或白细胞介素 10 （ interleukin 10,IL-10） 刺激时能够产生 IFN1.pDC 可高表达可诱导性共刺激因子 配 体 （ inducible costimulator ligand,ICOSL），并 分 泌IFN1、IL-6 等细胞因子促进 ICOSL 诱导 Tr-1 的过程[15].在临床移植中发现，以 pDC 为主的辅助细胞，参与临床移植耐受的诱导，具有十分重要的意义。pDC 可以在 TLR7 或 TLR9 配体的刺激下，上调 IL-10 并促进 B 细胞分泌 IL-10,可能参与局部耐受诱导微环境的形成[16]

　　3. 1 pDC 和中心性免疫耐受

　　pDC 在中心性免疫耐受的诱导和维持中起着非常重要的作用，该过程是通过清除自身反应性 T 细胞和产生 Foxp3+Treg 来实现的[4,17].来源于外周血的负载抗原的小鼠胸腺DC 可以清除抗原特异性 T 细胞。小鼠胸腺包括 3 个主要的DC 亚群，其中一群胸腺前体细胞来源的，发育成为信号调节蛋白 α（signal regulatory protein α，SIRPα）+CD11b+CD8α-的cDC,主要作用是调节 T 细胞的阴性选择，另外两群细胞是胸腺外 DC 归巢的 DC 群，包括 pDC 和一个 SIRPα+CD11b+CD8α-的 cDC 亚群[18].pDC 通过 CCR9 依赖的信号介导向胸腺迁移，此过程不需要 TLR 的信号刺激[14].pDC 在人类胸腺的胸腺皮质和髓质均有发现，事实上，多数pDC 来自胸腺外组织归巢，能够内吞和传递外周抗原，以供后续的递呈并促进中心性的耐受。在进入胸腺后，pDC 上调 CD11c、MHC-Ⅱ类分子和CD8α 的表达。胸腺 pDC 能够活化 nTreg 细胞发育[19].另外，人类的活化 pDC（TLR 刺激）可以诱导胸腺基质淋巴蛋白（thymicstromal lymphoprotein,TSLP ） 表达，并在 TSLP 诱导下促进CD4+CD8-CD25-胸腺细胞向 Foxp3+Treg 转化[21].与 cDC相比，产生大量的 IL-10 和 TGF-β是 pDC 诱导产生的 Treg 的特征。

　　3. 2 pDC 和黏膜免疫耐受

　　pDC 在诱导和调节针对消化道的无害抗原和吸入的抗原的黏膜免疫耐受方面有重要作用。小鼠肝组织内 pDC 可通过清除和诱导失能等抑制抗原特异性 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞反应[20].同时，在抗原接触前输入 pDC 清除抗体抗 Gr1 或者 120G8 均可抑制耐受的形成。人扁桃体 pDC 可诱导初始T 细胞向功能性的 CD4+CD25+CD127-（IL-7Rα）-Foxp3+Treg转化，并且与 CD4+Foxp3+Treg 共同定位于舌咽部和扁桃体[21].肺部 pDC 吞噬和递呈抗原并通过抑制 cDC 来抑制效应 T 细胞产生。过继这些 pDC 可以抑制小鼠过敏性哮喘，而清除 pDC 导致以 Th2 细胞相关性为主要特征的哮喘。pDC 同时参与清除原位病毒与诱导局部免疫耐受状态，因此 pDC 功能异常是哮喘的重要原因[22].pDC 表型或功能的不同，在针对共生细菌的消化道免疫耐受形成中具有重要作用，肝脏pDC 在介导内毒素耐受中有重要作用。肝内定植的 pDC 具有较低的免疫刺激活性，具有明确的免疫调节的作用。研究发现细菌胞壁酰二肽（muramyl dipeptide,MDP）可以通过激活pDC 表面核苷酸结合结构域 2 （ nucleotide binding domain 2,NOD2） 受体、活化 IRF4、阻断 TLR 传递的活化信号并上调程序性死亡蛋白1 配体1 （programmed death ligand-1,PD-L1,即B7-H1、CD274） 等机制，参与维持肝脏对肠内细菌产物的免疫耐受状态[23].另外，肝脏 pDC 上表达 IL-27p28 和 EB 病毒诱导的蛋白 B3（EBV-inducing protein B3,Ebi3），IL-27 可以通过信号转导子与转录激活子3（signal transducer and activator oftranscription 3,STAT3） 依赖途径上调 pDC 表达 PD-L1,动物实验发现，肝内 pDC 可以通过该机制抑制 MLR 时 T 细胞增殖，诱导产生 CD4+Treg,可能与肝脏移植容易产生移植耐受有关[24].

　　3. 3 pDC 和移植免疫耐受

　　表达 CCR9 的幼稚 pDC 可以诱导 Foxp3+Treg 产生，并在移植物抗宿主病（graft versus host disease,GVHD）模型中抑制抗原特异性的免疫反应。在该模型中发现，过继 CCR9+pDC可以有效的抑制 GVHD[14].Ochando 等发现，pDC 是具有吞噬作用的抗原提呈细胞，对于诱导异体心脏移植物的耐受和促进移植物血管化是必须的。在该模型中发现，在耐受诱导性环境中，提呈同种异体抗原的 pDC 归巢至淋巴结（lymphnode,LN），介导异体抗原特异性 Treg 发育和诱导移植免疫耐受。在另外的模型中发现，CCR7- / -基因敲除小鼠的 LN中由于没有 pDC 而导致 Treg 缺乏，可以导致移植物排斥，而过继野生型 pDC 可以重建针对心脏移植物的耐受，同时 Treg频率增加[26].在大鼠模型中发现，pDC 可以通过 2,3 吲哚酸二胺双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO）直接抑制CD4+T 细胞反应，或者间接通过 CD8+Treg 抑制[27].表达IL-12 的 pDC 参与了移植物抗白血病 （ graft versus leukemia,GVL） 的过程，该研究应用骨髓动员的 pDC 前体细胞辅助造血干细胞移植，发现可以提高供者 T 细胞抗白血病反应而减少 GVHD 的发生率[28].

　　临床器官移植耐受报道较少，故 pDC 在临床移植耐受诱导方面的作用还有待进一步研究。肝脏移植临床移植耐受发生率较高，因此目前分析 pDC 表型和肝脏移植物预后相关性的研究较多。在儿童肝脏移植的临床耐受患者中发现，较高比例的外周血 pDC 前体细胞数量（与 cDC 前体细胞相比）以及这些细胞表面 B7-H1（CD274） /CD86 比例升高，与 CD4+CD25+Foxp3+Treg 的数目增加有关[29].在儿童肝移植受者中，使用极低剂量或停用免疫抑制治疗的患者的外周血 pDC/髓系 DC 比例较正常维持剂量者更高，在使用低剂量免疫抑制剂的受者中发现，继续规律减量者外周血pDC/髓系 DC 比例高于使用原剂量维持者[30].Gupta 等[31]发现，儿童肝移植后用抗人甲状腺球蛋白诱导治疗，mDC/pDC 比例升高与晚期排斥增加有关，随后在临床小肠移植中发现，术后 mDC 和pDC 比例升高与急性排斥反应发生有关系，而与他克莫司血药浓度无关。

　　文献中对于 pDC 在临床干细胞移植中的作用以及其与临床预后之间的相关性（患者生存、无事件生存期、急性或慢性GVHD 发生率） 的关系存在严重分歧。目前认为结果变异主要与干细胞来源、治疗方案、pDC 分选方法以及是否进行pDC 来源分析有关。Leventhal 等[32]报道用以主要成分为pDC 前体细胞的助长细胞（ facilitating cell,FC） 联合无预清髓处理进行干细胞移植辅助肾移植，可以促进受者血细胞大嵌合（macrochimism）形成并诱导耐受，在 8 例患者中有 5 例成功诱导了嵌合，并于移植 1 年后成功停用了免疫抑制剂。随后 Leventhal 等[33]进行了里程碑意义的前瞻性研究，对以上同样方法进行了 2 期临床试验。共有 17 例患者入组，其中15 例顺利在术后 1 年内停用了免疫抑制剂，达到了临床耐受。在 15 例受者中共有 9 例检测到白细胞大嵌合形成，所有病例均未发生 GVHD,但受者保留了对非供者来源的抗原的免疫反应，在临床上提供了以 pDC 为主体的 FC 可以促进器官接受和免疫耐受的形成的证据。

　　3. 4 pDC 与自身免疫性疾病

　　在自身免疫性疾病中同样发现了 pDC 的免疫耐受诱导能力。在来自类风湿患者的成熟 pDC 表达高水平的 IDO,对诱导同种异体源性的初始 CD4+CD25-T 细胞向产生 IL-10 的Tr1 的分化是必须的[34].小鼠体内类风湿模型中清除 pDC,可以导致血管病理损伤加重以及 T 细胞和 B 细胞针对 2 型胶原蛋白的自身免疫反应水平提高[35].在用低剂量抗原脱敏治疗的系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）患者中，可以发现 pDC 产生转化生长因子 β（transforming growthfactor β，TGF-β）增多，抑制了 TLR 刺激的反应。过继耐受诱导性 pDC 可以扩增 Treg,并抑制小鼠的狼疮性肾病时炎症性Th17 细胞的浸润[36].靶向 pDC 的抗原可以抑制 Th 细胞依赖的自身免疫。小鼠实验性自身反应性脑脊髓膜炎（experimentalautoimmune encephalomyelitis,EAE）模型中发现，识别Siglec-H 介导的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55 片段（myelin oligodendrocyteglycoprotein 35-55,MOG33-35）转移至 pDC 可以减弱 EAE 病情，该过程与通过诱导MOG 特异性的CD4+T 细胞高反应性导致 Th1细胞和 Th17 细胞能力下降有关，而与促进 Treg 分化无关[37].

　　1 型糖尿病（type 1 diabetes,T1D）主要是由于机体产生针对胰岛 β 细胞的免疫反应导致，可在胰岛周围淋巴结发现针对胰岛 β 细胞的T 细胞。之前人们认为pDC 产生的IFN1 促进了T1D的发展，pDC 在巨细胞病毒（cytomegalovirus,CMV）等病毒感染过程中可以抑制针对胰岛 β 细胞的 T 细胞，从而抑制了 T1D 发展过程中针对胰岛β 细胞的免疫反应。在非肥胖型糖尿病（non-obese diabetic,NOD）小鼠中清除 pDC 将导致胰岛炎症和疾病加重，该过程与 IDO 减少有关，提示在 T1D 疾病过程中，pDC可能产生 IDO 依赖的耐受诱导功能来调节胰岛特异性 CD4+T 细胞反应[38].过继抗胰岛 T 细胞可以诱导在 NOD 小鼠中诱导T1D,而恒定自然杀伤 T 细胞（invariant nature killer T,iNKT）在胰腺周围淋巴结肿组织抗胰岛 T 细胞分化成为效应 T 细胞，其机制主要与pDC 在淋巴结肿诱导Treg 产生有关，而iNKT 可以促进此过程[39].

　　4 展望

　　随着对 pDC 研究的不断深入，其抑制免疫反应，负载外周抗原参与诱导中心性免疫耐受，诱导调节性T 细胞参与局部耐受等功能，提高了人们对于免疫耐受和移植免疫的认识，引起临床研究者的关注，已经开始在临床上应用该细胞辅助治疗临床移植免疫，诱导临床移植免疫耐受状态。同时，其诱导口服抗原耐受、控制病毒感染并参与控制呼吸道炎症状态，为临床治疗哮喘提供了新的可能，并且随着 pDC 在 NOD 过程中的作用研究不断深入，可能为治疗T1D 提供新的靶点。目前研究的瓶颈在于，循环 pDC 在全血中所占的比例较少，仅占外周血白细胞数的0.3%左右，体外扩增 pDC 以及体内鉴定和有效分离大量 pDC 仍有困难，限制了有关 pDC 诱导耐受的机制和临床应用的相关研究。

　　在采血前用 Flt3L 来扩增 pDC,可以提高循环 pDC 的数量，但达到临床需要的稳定功能的细胞数量仍有难度，亟需完善体外诱导pDC 发育和扩增的机制和方法的研究。pDC 具有比 cDC 更强的耐受诱导能力，可能是更合适的诱导临床免疫耐受的免疫细胞，随着基础研究的进展，pDC 应用于临床治疗将成为可能。