探讨降低S100A4表达对系膜细胞增殖的调控作用

　　持续的系膜增殖和系膜基质增多可导致不可逆性肾小球硬化〔1〕,抑制系膜细胞增殖是增殖性肾小球疾病重要的治疗策略。S100A4 是 S100 基因家族成员，是一种钙结合蛋白〔2〕,参与肾组织内上皮-间充质转分化过程〔3〕,其对肾小球系膜细胞增殖是否有影响尚未见报告。本研究通过体外培养大鼠系膜细胞，探讨降低 S100A4 表达对系膜细胞增殖的调控作用。

　　1 材料方法
　　
　　1. 1 实验材料 1640 细胞培养粉剂及 Tri201 试剂（ GIBCO 公司） ; MicroBCA 蛋白浓度检测试剂盒、MTT（ Sigma 公司） ; 小牛血清（ Fetal bovine serum,FCS,Hycolon 公司） ; 羊 S100A4 抗体、小鼠 p21 抗体、小鼠 cyclinD1 抗体、小鼠 CDK2 抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG、羊抗兔 IgG、脂质体 TransPass R2Transfection Reagent（ Biolab 公司） ; M-MLV 反转录酶（ Invitrogenlife technologies 公司） ; PCR 试剂 （ TaKaRa Biotechnology 公司） ;ECL 显色试剂盒（ Santa Cruz Biotechnology 公司） .

　　1. 2 大鼠肾小球系膜细胞系 RMC 的培养 雄性 Wistar 大鼠160 ~ 200 g 由吉林大学动物中心提供。无菌条件下取双侧肾脏，剥离肾包膜，肾皮质剪成碎块，放于重叠的三层不锈钢筛网上。收集第二层筛网上的组织移入离心管，V 型胶原酶（ 0. 5 mg/ml） 消化，15%胎牛血清的 RPMI 1640 培养液于37℃、5% CO2条件下培养原代的系膜细胞，7 d 传代，经 Desmin（ +） 、Ⅷ（ -） 鉴定后，用于以下实验。

　　1. 3 S100A4-15siRNA 的设计与合成 根据 Genbank 中大鼠S100A4-15 mRNA 全长序列（ AB020759. 1） 设计抑制 siRNA 的靶序列： 5'-AAGCCTTCTGTTCCTGCTACA-3',经上海吉玛公司合成双链 siRNA（ siS100A4） ,正义链： 5 '-GCCUUCUGUUCCUGCUACAtt-3',反义链： 3 '-ttCGGAAGACAAGGACGAUGU-5 '.同时合成无关 siRNA 序列作为对照（ siCon） : 正义链： 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3 ',反 义 链： 3 '-ttTTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5 '.合成的双链 siRNA 用 DEPC 处理的水溶解至100 μmol / L,-20℃ 冻存备用。

　　1. 4 siRNA 转染 细胞长至 50% ~ 60% 左右（ 以 12 孔板为例） ,进行如下转染步骤（ NEB TransPass R2 试剂盒） : ①25 μlA 液加入 0. 6 ml 无血清 1640 培养液中，混匀。②再加入2. 5 μlB 液体，混匀。③加入终浓度为 100 nmol / L 的 siRNA（ siCon 或siS100A4） .④室温静置孵育 20 min.⑤期间待转染细胞用无血清 1640 清洗 1 遍。⑥孵育液加到细胞培养皿，37℃培养4 h.⑦细胞中加 1 ml 正常 RPMI 1640 培养液（ 含血清） .⑧过夜培养。⑨更换新鲜的培养基培养 24 h 备用。

　　1. 5 细胞增殖的检测
　　1. 5. 1 MTT 法检测细胞增殖能力 大鼠系膜细胞 10 000 个 /孔接种于 96 孔板，无血清同步 16 h 后分为以下 4 组： ①无血清组； ②10%FCS 正常培养组； ③10% FCS+siCon 组； ④10% FCS+siS100A4 组，37℃ 孵育 24 ~ 48 h.在到达各时间点时弃去培养液，加入 MTT（ 终浓度 5 mg/ml） 20 μl,孵育 4 h,吸去上清，每孔加入二甲基亚砜（ DMSO） 200 μl,室温溶解15 min,分光光度计490 nm 读取 OD 值。每组设 6 个复孔，共重复 3 次。

　　1. 5. 2 流式细胞仪检测细胞周期 系膜细胞传代至25 cm2培养瓶中，无血清同步 16 h 后分组同上。培养 24 h 后收集细胞，PBS 液洗 2 次，加入 75% 乙醇固定，4℃ 过夜，次日离心后 PBS液洗 2 次，重悬于 0. 5 ml PBS 中。样品经 RNA 酶（ 50 μg/ml）处理后，碘化丙啶（ PI,50 μg/ml） 室温避光染色 30 min 后上机。应用 BD 流式细胞分析仪的 FACScan 测量 DNA 含量，细胞周期变化数据用 CellFIT Cell Cycle Analysis Version 2. 0 1. 2 软件分析（ BD 公司） ,以细胞周期各时相细胞百分率记录数据并分析。每组 3 瓶，重复 3 次。

　　1. 6 Western 印迹法检测 S100A4 对细胞周期调节蛋白 p21、cyclin D1、CDK2 表达 系膜细胞传代至 25 cm2培养瓶中，转染、无血清同步 16 h 后分组同上； 培养48 h 后0. 25%胰酶消化收集细胞。Western 印迹法步骤同上： 最后分别加入小鼠 cy-clinD1 抗体（ 1 ∶100 稀释） 、小鼠 p21 抗体（ 1 ∶ 100 稀释） 、小鼠CDK2 抗体（ 1 ∶100 稀释） 、兔 β-actin 抗体（ 1 ∶1 000 稀释） ,室温孵育 4 h; TBST 洗膜 3 次，分别加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG（ 1 ∶1 000 稀释） 、羊抗兔 IgG（ 1 ∶2 000 稀释） ,室温孵育45 min; TBST 洗膜 3 次； ECL 显影。ALPHAIMAGER 2200 凝胶图像分析系统半定量分析。

　　1. 7 统计学处理 计量资料采用 x±s 表示，MTT 实验采用双因素方差分析，其余采用单因素方差分析。两两比较采用 q 检验，采用 SPSS16. 0 软件进行数据处理。

　　2 结 果
　　
　　2. 1 MTT 检测 S100A4 对系膜细胞增殖速率的影响 转染抑制 S100A4 的 siS100A4 后 48 h 细胞数明显低于正常对照组和无关 siRNA（ SiCon） 组（ P<0. 05） ,见表 1.【表1】

　　2. 2 S100A4 对系膜细胞周期的影响 siRNA 抑制 S100A4 组S 期细胞以及 S+G2/ M 期细胞数（ 增殖指数） 明显低于正常对照组及无关 siRNA 转染组（ P<0. 05） ,见表 2.【表2】

　　
　　2. 3 Western 印迹法检测周期蛋白 CDK2、cyclinD1 和 p21 的表达变化 siRNA 抑制 S100A4 48 h 后，细胞周期蛋白 CDK2和 CyclinD1 均明显低于正常对照组及无关 siRNA 转染组（ CDK2 10% FCS+siS100A4 组： 0. 61±0. 02 vs. 10% FCS 正常培养组： 0. 33±0. 01; 10%FCS+siCon 组 0. 35±0. 01 P<0. 05,n=3,CyclinD1 10% FCS+siS100A4 组： 0. 61±0. 02 vs. 10% FCS 正常培养组： 0. 51±0. 01; 10% FCS+siCon 组 0. 46±0. 01 P<0. 05,n =3） ; 同样 p21（ 10. 45 ±0. 01,P <0. 05） 也出现类似的变化趋势。见图 1.【图1】

　　
　　3 讨 论
　　
　　本结果提示 S100A4 可能是细胞增殖的正调控因子，与其在心肌和平滑肌细胞的作用研究结果类似〔3 ~5〕.细胞周期的改变必然伴随着细胞周期蛋白的变化。在人类增殖性肾炎组织中肾小球内 E2F1、cyclinD1、CDK2 等细胞周期相关调控因子的表达显着上调〔6〕.本研究结果证实抑制 S100A4 可引起促进细胞进程的相关蛋白 CyclinD1 和 CDK2 的表达水平降低。但抑制细胞周期进程的基因 p21 却同样出现了下调，该基因的表达下调，可能是细胞周期负反馈调节的代偿现象，虽然表达下调，但可能不足以抑制促进细胞周期进程的相关蛋白的作用。

　　参考文献
　　
　　1 Mima A,Abe H,Nagai K,et al. Activation of Src mediates PDGF-inducedSmad1 phosphorylation and contributes to the progression of glomerulo-sclerosis in glomerulonephritis〔J〕。 PLoS One,2011; 22; 6（ 3） : e17929.
　　2 Garrett SC,Varney KM,Weber DJ,et al. S100A4,a mediator of metasta-sis〔J〕。 J Biol Chem,2006; 281（ 2） : 677-80.
　　3 Fernandez-Fernandez MR,Veprlntsev DB,Fersht AR. Proteins of theS100 family regulate the oligomerization of p53 tumor suppressor〔J〕。Proc Natl Acad Sci USA,2005; 102（ 3） : 4735-40.
　　4 Liu T,Li Y,Lin K,et al. Regulation of S100A4 expression via the JAK2-STAT3 pathway in rhomboid-phenotype pulmonary arterial smooth musclecells exposure to hypoxia〔J〕。 Int J Biochem Cell Biol,2012; 44 （ 8 ） :1337-45.
　　5 Sack U,Walther W,Scudiero D,et al. Novel effect of antihelminthicNiclosamide on S100A4-mediated metastatic progression in colon cancer〔J〕。 J Natl Cancer Inst,2011; 103（ 13） : 1018-36.
　　6 Xie Y,Chen X. Epidemiology,major outcomes,risk factors,preventionand management of chronic kidney disease in China〔J〕。 Am J Nephrol,2008; 28: 1-7.