目前，应用神经组织工程学的方法来促进面神经的再生和修复已成为当今研究的新热点，我们在前期实验中应用神经干细胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＮＳＣｓ）移植到可吸收的神经导管修复面神经的缺损取得的不错的效果，但在实验中发现来源于中枢的髓磷脂相关抑制物 （Ｎｏｇｏ－Ａ，ｍｙｅｌｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔ－ｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｎｏｇｏ），髓磷脂相关糖蛋白 （ｍｙｅｌｉｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＡＧ），少突细胞－髓磷脂糖 蛋 白 （ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ－ｍｙｅｌｉｎｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，Ｏｍｇｐ）是阻碍神经再生的重要因素，这些因子都通过共同受体Ｎｏｇｏ受体（Ｎｏｇｏ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＮｇＲ）起作用，因此，我们应用ＲＮＡｉ抑制ＮＳＣｓ中ＮｇＲ的表达来探讨修复大鼠面神经缺损。
１材料与方法
１．１材料和试剂
ｐＧＣｓｉ载体、感受态大肠杆菌ＤＨ５α购自上海吉凯公司、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００、ＮｇＲ、ＭＡＰ－２抗体购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，各种胎牛血清、ＥＧＦ、ｂＦ－ＧＦ购自Ｒ﹠Ｄ公司，ＰＬＧＡ导管购自上海天清生物公司，其规格为内径０．８ｍｍ，外径１．２ｍｍ。
１．２方法
１．２．１ ＮＳＣｓ培养及鉴定 孕１０ｄ左右的ＳＤ大鼠，取其胚胎海马组织，进行ＮＳＣｓ的原代培养、３～４ｄ半量换液，５～７ｄ传代。种植ＮＳＣｓ于涂有多聚赖氨酸的小玻片上，采用甲醛固定，血清封闭，分别加入相应抗体等步骤后在显微镜下观察染色情况。具体步骤见文献〔１〕。
１．２．２ ＮｇＲ ｓｈＲＮＡ表达载体的构建、扩增及鉴定 根据ｓｈＲＮＡ的设计原则、载体ｐＧＣｓｉ的酶切位 点 以 及ＧｅｎＢａｎｋ中ＮｇＲ的 编 码 序 列（１２４０７６５０），参考文献〔３〕合成针对ＮｇＲ编码区３６０－３８０ｂｐ和１２０５－１２２５ｂｐ（ＡＡＴＣＴＴＣＣＴＧ－ＣＡＴＧＧＣＡＡＣＣＧ）（ＡＡＧＣＣＴＣＡＧＴＡＣＴＧＧＡＡ－ＣＣＣＧ）为小发夹的靶向的ＤＮＡ片段。设计好的发夹送由上海生工有限公司定制合成，将人工合成的ＤＮＡ序列的两条链，进行等浓度的退火结合，９５℃加热５ｍｉｎ，然后降至室温，形成具有粘性末端的互补双链，３ｈ后与酶切后ｐＧＣｓｉ载体产物在Ｔ４连接酶作用下连接，转化大肠杆菌感受态细胞，然后将１５０μｌ已转化的感受态细胞转移到琼脂培养液上，３７℃过夜培养，克隆产物测序鉴定。
１．２．３脂质体介导ＮｇＲ ｓｈＲＮＡ转染ＮＳＣｓ按照Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００的说明书进行脂质体转染。转染前１ｄ，于六孔板内接种１×１０５细胞，加入１５％ ＦＢＳ的ＤＭＥＭ ２ｍｌ进行培养，将２μｇ ＮｇＲ ｓｈＲＮＡ质 粒 和４μｌ ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００先 分 别 用２５０μｌ不 含 抗 生 素 和 血 清 的ＤＭＥＭ稀释，后将稀释的质粒和ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００混合，室温孵育２０ｍｉｎ。把这５００μｌ混合物加入六孔板的培养液中，来回摇晃以混匀。设立实验组、空质粒对照组。细胞于３７℃、５％ ＣＯ２的培养箱中继续培养，转染６ｈ后更换为含抗生素和血清的ＤＭＥＭ培养液，３ｄ后在荧光显微镜下观察ＧＦＰ的表达，计算其转染效率。
１．２．４ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ检测ＮＳＣｓ中ＮｇＲ的表达分别取实验组和空质粒对照组的ＮＳＣｓ，转染３ｄ后见明显荧光，用冰预冷的ＰＢＳ洗２次，加入细胞裂解液裂解抽提蛋白，按照Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ实验技术操作说明分别进行蛋白定量，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳、转膜、封闭，及加入羊抗的ＮｇＲ抗体和兔抗羊的二抗进行杂交、洗膜等操作后，把膜与Ｓｕｐｅｒ ＳｉｇｎａｌＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ化学发光底物室温孵育５ｍｉｎ，曝光Ｘ光片，然后显影定影。
１．２．５经ＮｇＲ ｓｈＲＮＡ干扰后ＮＳＣｓ的分化干扰后３ｄ把有明显荧光的ＮＳＣｓ直接接种于涂有多聚赖氨酸的盖玻片上，置于３５ｍｍ培养皿，待细胞贴壁后加入ＮＳＣｓ的分化培养液，２周后进行干细胞的分化鉴定，用甲醛固定，血清封闭，分别加入ＭＡＰ－２抗体等方法进行神经元的鉴定，以未干扰的ＮＳＣｓ分化作为对照。在Ｌｅｉｃａ ＱＷ３图像分析软件下在２００倍视野下进行细胞计数，每组观察５张盖玻片，每张盖玻片观察６个不重复视野，计算各组神经元占总细胞数的比例，数据以ｘ珚±ｓ表示，应用ＳＰＳＳ １２．０统计软件，两组间数据比较采用ｔ检验，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
１．２．６干扰后ＮＳＣｓ移植入ＰＬＧＡ管，进行场扫描电镜观察干扰后的ＮＳＣｓ生长至培养瓶的７０％～８０％密度后，离心５ｍｉｎ，去除上清液，加入１ｍｌ培养液，吹打后，计数板计数，得到细胞数约为（０．５～１．０）×１０５／ｍｌ，取出细胞悬液１００μｌ加入细胞外基质２００μｌ，形成混合液，将混合液注入培养液浸泡的ＰＬＧＡ管内，将ＰＬＧＡ管置于培养皿中，移入培养箱。种植后４ｈ后发现细胞贴壁后加入干细胞的分化培养液，２周后，送至同济大学电镜室进行场扫描电镜观察。
２结果
２．１ ＮＳＣｓ培养结果
培养７ｄ左右可见数十个乃至数百个细胞组成的神经球，细胞免疫化学结果示Ｎｅｓｔｉｎ阳性，诱导分化可见大量形态各异的神经细胞，这些结果证实了所培养的细胞为ＮＳＣｓ。
２．２重组质粒的构建结果及转染结果
构建了２个ＮｇＲ－ｓｈＲＮＡ表达载体质粒，分别命名为Ｐ１、Ｐ２，并经测序鉴定证实，所含目的基因序列准确无误，重组质粒构建成功。
ＮｇＲ－ｓｈＲＮＡ经脂质体介导转染ＮＳＣｓ，Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ检测结果：转染７２ｈ后，脂质体组可抑制ＮｇＲ蛋白的表达，而裸质粒组对ＮｇＲ蛋白的表达无明显影响（图１）。转染７２ｈ后在倒置荧光显微镜下观察细胞，Ｐ１、Ｐ２、阴性对照组均可见较多细胞表达绿色荧光，初步计算转染效率为４０％～５０％，各组间差异无统计学意义（图２）。ＮＳＣｓ转染后神经元的分化结果：沉默了ＮｇＲ的ＮＳＣｓ，分化２周后向神经元分化的比例明显高于未转染组（图３），神经元比例分别为４６．７９±４．１０、２２．２６±４．５４，差异有统计学意义。
２．３场扫描电镜观察种植
ＮＳＣｓ的ＰＬＧＡ管在分化２周后可见导管壁上生长着各种形态的神经细胞（图4）
３讨论
目前，面神经断伤后的再生与修复仍是一项挑战性难题。近年来组织工程修复神经缺损已越来越受到重视，我们在前期实验中应用ＮＳＣｓ移植到可吸收的神经导管修复面神经的缺损取得的不错的效果，但在实验中发现来源于中枢的Ｎｏｇｏ－Ａ、ＭＡＧ、Ｏｍｇｐ是阻碍神经再生的重要因素，这些因子都通过共同受体ＮｇＲ起作用，现已经证实它们对损伤后中枢神经的再生具有抑制作用，如果在基因水平下抑制ＮｇＲ的表达，可直接减轻髓磷脂相关抑制物的抑制作用。近２年来发展迅速的小分子ＲＮＡ干扰技术，提供了这种可行性。
ＲＮＡ干扰是指通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的小的双链ＲＮＡ，诱导内源性靶基因降解，达到阻止基因表达的目的，如何干扰ＮｇＲ成为当前研究的重点。以ｓｉＲＮＡ实现基因沉默是将关于髓隣脂相关抑制因子的基础研究转化为基因干扰策略，ＮｇＲ被认为是目前的最佳干预靶点。Ｌｉ等将可溶性的大鼠ＮｇＲ１蛋白进行膜内注射，该蛋白融入了大鼠的ＩｇＧ１区，观察脊髓脊髓胸段半切断的大鼠脊髓轴突变化。发现经ｓＮｇＲ１－Ｉｇ治疗后轴突再生明显，而且功能明显的。
Ｋｉｍ等的研究也发现ＮｇＲ基因缺陷小鼠脊髓全部横断１４周后行为学评估有了很大改善。在周围神经损伤修复中，有文献报道坐骨神经切断后局部应用ＭＡＧ可以减少损伤促进能够的恢复，但较少涉及到ＮｇＲ的表达。我们前期实验应用ＮＳＣｓ移植修复周围性面神经的损伤，虽然实验证实有较好的神经修复结果，但由于原代培养的细胞来自于中枢的海马组织，体内外分化成胶质细胞的比例要大于神经元，髓磷脂相关抑制物的存在也进一步抑制了神经修复的结果。因此我们在本实验中成功构建了ＮｇＲ－ｓｈＲＮＡ表达载体质粒，并通过稳定的脂质体介导成功转染ＮＳＣｓ，Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ的结果显示干扰后ＮＳＣｓ中ＮｇＲ基因的表达较前减弱，转染后神经元的分化比例也明显高于转染前，从而为我们下一步的体内实验提供更好的神经营养支持。
总之，本研究成功干扰了ＮＳＣｓ中ＮｇＲ的表达，使ＮＳＣｓ向神经元进一步分化，能更有效促进神经轴突的再生，为促进周围性面神经再生修复提供更好的种子细胞。
参考文献
［１］ 施勇，周梁，田洁，等．神经干细胞移植到神经导管修复大鼠面神经缺损的研究［Ｊ］．临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，２０１２，２６（２２）：１０４０－１０４２．
［２］ＧＲＡＮＤＰＲＥ Ｔ，ＮＡＫＡＭＵＲＡ Ｆ，ＶＡＲＴＡＮＩＡＮ Ｔ，ｅｔａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｇｏ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｘｏｎ ｒｅｇｅｎｅｒａ－ｔｉｏｎ ａｓ ａ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０３：４３－４４．
［３］ 王朝鲁，孙红辉，杨有庚．Ｎｏｇｏ受体基因干扰ＲＮＡ表达载体的构建［Ｊ］．中国实验诊断学，２００６，１０（１１）：１２５３－１２５４．
［４］ＷＡＮＧ Ｙ Ｔ，ＬＵ Ｘ Ｍ，ＺＨＵ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａｇｏｌｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂａｓｅｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｔｈｅｒａ－ｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｈＮｇＲ－Ｆｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ－ｉｎｊｕｒｅｄ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１１，３２：７９８８－７９９８．
［５］ＳＡＲＡＨ Ｃ，ＢＯＲＲＩＥ ＢＡＳＴＩＡＮ Ｅ，ＢＡＥＵＭＥＲ ＣＨ－ＲＩＳＴＩＮＥ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｎｏｇｏ－６６ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ ｉｎｔｈｅ ｉｎｔａｃｔ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅｄ ＣＮＳ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ，２０１２，３４９：１０５－１１７．
［６］ＧＩＴＬＩＮ Ｌ，ＫＡＲＥＬＳＫＹ Ｓ．Ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｃｏｎｆｅｒｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８：４３０－４３４．
［７］ＭＣＤＯＮＡＬＤ Ｃ Ｌ，ＢＡＮＤＴＬＯＷ Ｃ，ＲＥＩＮＤ Ｍ．Ｔａｒ－ｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｇｏ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓ－ｔｒｙ，２０１１，１８：２３４－２４４．
［８］ＬＩ Ｗ，ＷＡＬＵＳ Ｌ，ＲＡＢＡＣＣＨＩ ＳＡ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｅｕ－ｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉ－Ｎｏｇｏ６６ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅ－ｖｅｒｓｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｂｙ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖ－ｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｍｙｅｌｉｎ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００４，２７９：４３７８０－４３７８８．
［９］ＫＩＭ Ｊ Ｅ，ＬＩＵ Ｂ Ｐ，ＰＡＲＫ Ｊ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｎｏｇｏ－６６ｒｅ－ｃｅｐｔｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｒａｐｈｅ ｓｐｉｎａｌ ａｎｄ ｒｕｂｒｏ ｓｐｉｎａｌ ａｘｏｎ ｒｅ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ｓｐｉｎａｌｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｎ，２００４，４４：４３９－４５１．
［１０］ＫＯＩＣＨＩ Ｔ，ＴＡＴＥＫＩ Ｋ，ＫＥＮ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍｙｅｌｉｎ－ａｓ－ｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ａｘｏｎａｌ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ａｎｄｅｎｈａｎｃｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ ｓｃｉａｔｉｃ ｎｅｒｖｅ ｔｒａｎ－ｓｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｇｌｉａ，２００７，５５：１４９８－５０７
