Ass1在不同组织中的表达定位、调节及生理病理功能阐述,生理学论文

　　精氨琥珀酸合酶（ argininosuccinate synthase 1,Ass1）能够催化瓜氨酸和天冬氨酸形成精氨琥珀酸，在精氨琥珀酸裂解酶（ argininosuccinate lyase,Asl）的作用下，生成精氨酸。精氨酸通过精氨酸酶水解生成尿素和鸟氨酸，鸟氨酸既可以被鸟氨酸脱羧酶代谢，生成多胺；也可以在鸟氨酸转氨酶作用下重新生成瓜氨酸，形成尿素循环；另外，精氨酸还可以通过一氧化氮合酶（ nitric oxide synthase,NOS）作用生成一氧化氮（ nitric oxide,NO）和瓜氨酸，形成瓜氨酸---一氧化氮循环。因此，Ass1 是生成精氨酸、尿素和 NO 的关键限速酶。根据精氨酸的代谢途径不同，Ass1 在组织中表达水平也是不同的。本篇综述主要就 Ass1 在不同组织中的表达定位、表达调节及生理和病理功能进行阐述。

　　一、Ass1 的生化结构
　　
　　Ass1 为编码精氨琥珀酸合酶的基因，位于第 9号染色体。Ass1 由同源四聚体构成，包含 412 个氨基残基。比较 cDNA 序列发现，Ass1 在人、牛、大鼠和小鼠中高度同源。它能催化瓜氨酸与天冬氨酸在ATP 的作用下生成精氨琥珀酸。人的 Ass1 结构包含三个主要部分：核苷酸结合部分、合成酶部分及多聚化的螺旋 C 端。对瓜氨酸血症的病人研究发现，Ass1 有多种突变位点。大多数位点突变后会破坏它们与周围单体形成二聚体或使它们与周围单体的作用缺失，导致构象改变和电子的重新分布。此外，一些突变位点是直接与底物结合（如 Gln40（ Leu）和Arg127（ Gln）） ,并很可能对催化活性起直接作用。

　　还有一些位点突变（如 Val345（ Gly）） ,使得一些和瓜氨酸相互作用的区域和大部分寡聚化区域缺失，使蛋白不能正确的折叠。

　　二、Ass1 的表达定位
　　
　　Ass1 早期发现于肝细胞中。在成年大鼠的肝和肾中表达量和酶活性最高，而在小肠组织中表达量较低；相反，Ass1 在大鼠胎儿的小肠中表达量最高。在出生时，Ass1 表达水平已达到成年大鼠的一半，随后在发育过程中迅速增加，这种表达趋势和人类似。在大鼠的肝中，Ass1 主要表达在门静脉周围的肝细胞，而在其他地方肝细胞中表达量较低。在正在发育的大鼠小肠中，Ass1 主要定位在小肠绒毛上，而在绒毛之间的部位表达较少。但 Ass1 这种分区表达可能是物种依赖性的，因为在人的肝细胞中还没有分区表达报道。

　　Husson 等（ 2003 ）发现 Ass1 在多种细胞中表达，如牛的动脉内皮细胞，小鼠和大鼠的巨噬细胞，大鼠和人的胰脏细胞，大鼠血管平滑肌细胞，甚至在大鼠的眼细胞、神经胶质细胞和神经元中均有发现。这些发现显示了 Ass1 是一种广泛表达的酶。进一步对 Ass1 的亚细胞定位研究显示，不同类型细胞中 Ass1 的亚细胞定位不同。肝细胞中部分Ass1 分布于线粒体的外膜，并且这种分布在发育过程中是变化的。在大鼠胎儿的肝细胞中，有 90% 的Ass1 分布于线粒体，而成年大鼠的肝细胞中只有30% 的 Ass1 分布在线粒体。在牛的动脉内皮细胞中，Ass1 定位于质膜周围。而在肠上皮细胞或者肾小管细胞中，Ass1 分布于胞质中。Ass1 的不同亚细胞定位可能与它发挥的生理功能相关。

　　三、Ass1 的表达调节
　　
　　Ass1 是一种广泛表达的酶，它的表达与组织、细胞的类型有关。Ass1 的表达受到一些刺激物如激素、炎症因子、细胞因子、脂多糖（ lipopolysaccha-ride,LPS）等调节。这些刺激物主要是从转录水平和转录后水平调节 Ass1 的表达和酶活性。

　　（一）转录水平调节人的 Ass1 启动子 5‘端800bp 有 1 个 TATA 区、六个 Sp1 结合位点、和 1 个AP2 结合位点。但仅仅只有 3 个 GC boxes 能结合Sp1,形成 Sp1-DNA 结构，增强启动子的转录活性。
　　
　　一些启动子功能研究和突变小鼠的模型分别集中在对环腺甘酸应答元件结合蛋白（ cAMP response ele-ment-binding protein,CREBP）和 CCAAT / 增强子结合蛋白 α （ CCAAT/enhancer-binding protein α，C/EBP α）的研究。组织特异清除者 1 （ tissue-specificextinguisher locus,Tse-1 ）编码蛋白激酶 A （ proteinkinase A,PKA）的调节亚基 R1α，而 CREBP 是 Tse-1 抑制的靶基因，Tse-1 可能通过抑制 CREBP 来抑制 Ass1 在肝细胞中的表达。Guei 等（ 2008）利用DNaseⅠ高敏感位点图谱鉴定方法，在 Ass1 的转录起始位点上游的 10kb 上，鉴定出一个 cAMP 反应元件（ CRE） .此外，对 7 号染色体上敲除白化病基因座的纯合小鼠的研究发现，肝脏中 Ass1 的转录水平下降，主要是由于 C/EBPα 的表达受到抑制。而且，在 C/EBPα 敲除的鼠中，肝功能紊乱，尿素生成受到抑制。在这些小鼠中，Ass1 mRNA 水平降低。因此，C/EBPα 可能调节 Ass1 基因的表达，但在 C/EBPβ 敲除的鼠中没有发现类似结果。Tsai 等认为Ass1 启动子上近端区域也包含一个 E-box 区和一个GC box 区。在精氨酸缺失条件下，c-myc 结合到 E-box 区，Sp4 与 GC box 区结合，这种结合对 Ass1 表达具有正调控作用，而在正常条件下，缺氧诱导因子1a（ hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF1α）结合到E-box 区，对 Ass1 表达具有负调控作用.一些其它的转录因子，如肝核因子 1（ hepatic nuclear factor1,HNF1）、激活转录因子 2 （ activating transcriptionfactor 2,ATF2 ）、激活转录因子 4 （ activating tran-scription factor 4,ATF4 ）、核因子-kappa b （ nuclearfactor-kappa b,NF - κB）、过氧化物酶体增生物激活受体（ peroxisome proliferator-activated receptor,PPRE）都对 Ass1 的调控中发挥重要的作用。此外，在某些肿瘤细胞中，Ass1 的启动子上 CpG 岛发生甲基化，在转录水平上沉默了 Ass1 的表达.

　　（二）转录后水平调节
　　1. 5' UTR 区调节：肝脏是尿素生成的重要部位，内皮细胞是 NO 产生的重要部位，对肝脏和内皮细胞中 Ass1 5'UTR 序列研究发现，两者除了共有一段距离转录起始位点 43 个核苷酸片段以外，内皮细胞中表达的 Ass1 的 5'UTR 序列中还增加了一段重叠的核苷酸序列，距离转录起始位点 66 到 92 个碱基，使得 5'UTR 区呈多态性。Laura 等（ 2005）进一步研究发现，内皮细胞中的 Ass1 的 5' UTR 序列所含的上游开放阅读框可以调节其在内皮细胞中的表达。过表达上游开放阅读框抑制 Ass1 蛋白的翻译，特异性的沉默上游开放阅读框能上调 Ass1 蛋白和 NO的水平。

　　2. 磷酸化和亚硝酸化调节： Ass1 的表达和酶活性是生成 NO 的关键因素。在血管内皮细胞中，蛋白激酶 C-α（ protein kinase C alpha,PKCα）磷酸化Ass1 328 位丝氨酸位点，调节 Ass1 酶活性，促进 NO的产生.然而，Laura 等（ 2005）在体内和体外的一些实验表明，过多的 NO 会导致 Ass1 的 Cys-132位点发生 S-亚硝基化，在翻译后水平上抑制了 Ass1的酶活性，减少精氨酸的生成，限速了 NO 的产量。

　　四、Ass1 的生理和病理功能
　　
　　Ass1 在不同组织细胞中的表达决定了其不同的生理功能。在肝脏中表达的 Ass1,主要功能是通过尿素循环，将体内产生的氨转换为尿素，是氨解毒的重要途径。在肾皮质中表达的 Ass1 主要为整个机体提供精氨酸。而在许多其他类型的细胞中，Ass1 生成的精氨酸用于 NO 的合成。目前，Ass1 在肿瘤治疗、NO 生成、糖尿病的治疗、经典瓜氨酸血症中进行了大量的研究。

　　（一）与肿瘤治疗 Ass1 是生成精氨酸的限速酶，Ass1 的失调导致精氨酸含量的改变。精氨酸又是激发多种代谢途径的前体物质，除了用于蛋白质的合成，还用于 NO、多胺、尿素、核酸、肌酸、脯氨酸、谷氨酸和精胺的合成。精氨酸和这些下游分子共同参与了肿瘤的生长、增殖、侵入、免疫、转移和血管生成。对含有编码癌症基因的小鼠或者移植肿瘤的小鼠喂食精氨酸，能增加肿瘤生长，在饲料中缺失精氨酸，可以抑制肝脏的肿瘤转移。Szlosarek 等（ 2007）研究卵巢癌中发现，肿瘤坏死因子-α（ tumornecrosis factor - alpha,TNF-α）与 Ass1 表达共定位，并诱导 Ass1 高表达，这种现象也发现在非小细胞肺癌和胃癌中，Ass1 的高表达可能是为了满足癌细胞对精氨酸代谢的需求。TNF-α 对 Ass1 的调节为炎症和代谢之间提供了重要的分子途径。然而在黏液纤维肉瘤中，Ass1 的启动子发生表观遗传学调控，沉默了 Ass1 的表达，导致精氨酸营养缺陷，出现顺铂耐受的现象.Ass1 表达越少，肿瘤的级别和阶段越高。Ass1 表达的缺失，可能是机体抵抗恶性肿瘤的自我防御保护。这些肿瘤由于自身不能生成精氨酸，而依赖于体外精氨酸的供给获得生长，因而只要降解体外获得的精氨酸就能促进肿瘤细胞的凋亡。临床上使用 arginine deiminase（ ADI-PEG 20） ,导致 Ass1 甲基化的细胞激活 BAX 信号通路，诱导细胞凋亡，这种方法在精氨酸营养缺陷的肿瘤中如肝癌、骨肉瘤、恶性黑色素瘤中起到了很好的治疗效果.但在治疗一些黑色素瘤等肿瘤中会出现 ADI耐受的现象，这是由于一方面精氨酸的缺失，诱导肿瘤细胞发生自体吞噬，重新利用胞内的精氨酸存活；另一方面，ADI-PEG20 激活 Ras /PI3K/ERK 信号通路，诱导 c-Myc 稳定的表达，促进 Ass1 表达上调.

　　对于 ADI 耐受的动物模型，一般采用 PI3K 抑制剂和 ADI-PEG20 联合治疗，效果比单独使用其中一种药物要显着的多。目前，对于一些 Ass1 低表达的肿瘤，可以判断为是精氨酸营养缺陷型肿瘤，降低这些肿瘤中精氨酸的含量已被认为是药理学发展的潜在治疗目标。

　　（二）对 NO 合成的作用 Ass1 也是 NO 生成中的关键限速酶。NOS 利用精氨酸作为底物，将其转换成瓜氨酸和 NO.过表达 Ass1 可以促进 NO 的产生.此外，Ass1 的动态磷酸化水平影响了血管内皮 NO 的产生.在血管内皮细胞中，使用 siAss1干涉后，诱导细胞凋亡，当加入 NO 供体后，能够抑制由于 Ass1 表达过低而导致的细胞凋亡。因而，Ass1 对内皮细胞 NO 的产生和保护细胞活性都是非常重要的。在这些细胞中，加入 Ass1 的产物精氨酸可以促进血管生成蛋白血管内皮生长因子（ vascularendothelial growth factor,VEGF）、前列腺素 E2（ pros-taglandin E2,PGE2）、基质金属蛋白酶 2（ matrix met-alloproteinase-2,MMP2）、CD51、CD61 的表达。当在此基础上添加 NOS 抑制剂后，这些血管生成的蛋白降低到低浓度精氨酸处理的水平.因此，可以推测 Ass1 是通过其产物精氨酸生成 NO 参与血管蛋白的表达。在神经干细胞中神经型一氧化氮合酶（ neuronal nitric oxide synthase ,nNOS）与 Ass1 共定位，促进神经干细胞的分化。LPS 和 TNF-γ 联合处理大鼠小神经胶质细胞，能诱导 Ass1 和诱导型一氧化氮合酶（ inducible nitric oxide synthase,iNOS）的共表达。这种作用也被发现在体内给大鼠注射 LPS后，多种组织包括心，肾，肺和脾都有 Ass1 和 iNOS的共诱导。层流剪切应力是产生脉动血流，保证血管健康的重要因素，它也可以促进 Ass1 和内皮型一氧化氮合酶（ endothelial nitric oxide synthase,eNOS）的表达，增加 NO 的产生,而 NO 是血管健康所必需的，可以抑制血管细胞表面粘附分子 VCAM-1 的表达，阻止炎症单核细胞粘附到内皮细胞上。

　　（三）糖尿病血管内皮细胞 NO 含量降低是糖尿病发病机制的一个主要因素。糖尿病病人内皮细胞功能失调，同时血清中 TNF-α 含量增加。Good-win（ 2007）研究发现 TNF-α 不仅抑制 eNOS 的表达，同时协调性的抑制 Ass1 在动脉内皮细胞的表达，导致严重的瓜氨酸-NO 循环受损，进而损伤内皮细胞的活性。STZ 诱导的大鼠糖尿病冠状内皮细胞中，Ass1 的表达量降低，补充胰岛素，可以恢复降低的Ass1 的表达水平，促进 NO 的生成。这个实验在培养的血管内皮细胞中也得到验证.此外，一些证据显示，饮食中补充精氨酸，可以减轻先天性肥胖大鼠、饮食诱导的糖尿病大鼠、2 型糖尿病人的肥胖症，但具体的作用机制是复杂的。精氨酸可能通过增强细胞信号分子的合成（如 NO、CO、多胺、cGMP和 cAMP）和促进葡萄糖、脂肪发生氧化作用的基因产生，刺激线粒体中的物质合成以及棕色脂肪组织的发育，改变能量摄入和消耗的平衡，更利于脂肪消耗和减少白色脂肪组织.

　　（四）精氨琥珀酸缺失症目前，至少有 22 种已知的 Ass1 基因突变造成的精氨琥珀酸缺失症（ ASD） .基因突变包含错义突变，无义突变，外显子突变。这些突变造成尿素循环失调，引起氨和其他有毒物质在血液中累积，形成经典的瓜氨酸血症，容易引起较高的胎儿发病率和死亡率。Ass1 缺失的小鼠，其表型非常类似于人的经典的瓜氨酸血症，表现出生长停滞，在出生后 24 小时或 48 小时内死亡。

　　大约 20 年前，就有了基因移植的治疗方案。使用携带人的 Ass1 cDNA 逆转录病毒注射小鼠，小鼠可以长期表达人的 Ass1 基因，并且这种方案已经可以延长经典瓜氨酸血症的小鼠寿命，并提高了小鼠的体重.通过对瓜氨酸血症的新生牛注射表达人的Ass1 的腺病毒，也可以部分恢复 Ass1 的酶活性。目前，根据激活消耗氮的排泄物的途径设计出特殊的治疗 ASD 的方案，研发出一些药物。然而，这些药物尽管提高了存活率，但这些病人仍然有神经衰退，生长迟缓的现象和有高氨血症发作的风险.

　　五、结语与展望
　　
　　大约 50 年前，发现 Ass1 是肝脏中特异表达的酶，现在发现它是一种广泛存在的酶。作为生成精氨酸的限速酶，Ass1 在机体内的表达和调节对精氨酸的合成以及精氨酸的代谢途径有重要意义。不同的调控机制决定着 Ass1 在组织、细胞中的表达差异，也决定着 Ass1 的不同的生理功能。除了参与精氨酸合成，瓜氨酸-尿素循环，瓜氨酸-NO 循环外，在某些肿瘤、糖尿病的发生和治疗以及经典的瓜氨酸血症治疗中也起重要的作用。因此，深入研究 Ass1在不同组织中的表达调控和生理及病理作用，都是今后重要的发展方向。