BDNF在鸟类鸣唱学习记忆中作用研究

　　引 言

　　鸟类鸣唱是一种复杂的发声行为，需要感知和运动技能学习等神经过程的参与。与人类语言学习的过程相似，鸟类鸣唱学习过程由脑中的一整套神经结构所控制，我们称之为鸣唱控制系统[1]。该系统由发声运动通路 (vocal motor pathway，VMP) 和前端脑通路(anterior forebrain pathway，AFP) 构成。VMP 直接对鸣唱行为进行调节，其由端脑高级发声中枢(high vocal center，HVC) 发出神经纤维投射至弓状皮质栎核 (robust nucleus ofthe arcopallium，RA)，再由 RA 经脑干舌下神经气管鸣管亚核 (the tracheosyringeal part ofhypoglossal nucleus，nXIIts) 支配鸣肌以控制鸣唱行为。HVC 腹侧壳区接受前脑听区的听觉信息传入，并通过其中的HVCX投射神经元与 AFP 相联系。AFP 由 X 区 (类似于哺乳类的基底神经节)、丘脑背外侧核内侧部(medial portion of the dorsolateral nucleus of theanterior thalamus，DLM) 和新纹状体前部巨细胞核外侧部 (lateral part of the magnocellularnucleus of the anterior neostriatum，LMAN)构成环路，其相当于哺乳类的丘脑-皮层-基底神经节通路，在幼鸟鸣唱学习和鸣曲定型后的维持过程中起关键作用。AFP 与 VMP 之间，除了X 区接受 HVCX投射神经元的纤维投射外，LMAN 也向 RA 发出纤维投射，使两条通路紧密相连(图1)。上世纪 60 年代开始，对鸟类鸣唱学习行为的研究逐渐开展起来，尤其在1984 年发现成年鸣禽 HVC 中存在新生神经元之后，引起了神经科学界的广泛关注，同时更将该领域的研究推向纵深。目前，鸟类鸣唱控制系统已成为学习记忆研究领域的重要模型，对其深入研究可为我们透视脑与行为的关系带来重大启示，并为解决帕金森病、急慢性中枢神经系统损伤等神经系统疾病提供重要理论依据。

　　

　　在许多种类的鸣禽中，鸣唱通常是雄性相关行为，雄鸟通过鸣唱进行求偶。鸣唱控制核团呈现明显的性别二态性，即在雄鸟中更大也更明显[4]。研究表明，脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF) 在鸣唱控制系统对鸣唱行为的调控中起关键作用。BDNF 是一种重要的神经营养因子，其在神经系统发育过程中起重要作用，并且是神经系统功能的重要调节剂。BDNF 对神经细胞的增殖、再生、分化、生长、存活、电生理活动、递质传递乃至突触可塑性等均有重要影响，并参与对学习记忆等神经过程的调控。

　　本文对 BDNF 在鸟类鸣唱学习记忆中作用的研究概况及进展进行了详细论述。

　　BDNF 及其受体在鸣唱控制系统内的表达分布BDNF 在鸣唱控制系统内的表达分布在 4000 多种鸣禽中，斑胸草雀 (zebra finch) 因其外形、鸣唱行为及鸣唱相关神经结构具有典型的性别二态性，被世界各国广泛用于有关鸟类鸣唱的神经生物学研究。已有研究表明，BDNF 在鸣唱控制系统及鸣唱行为性别二态性的形成中起重要作用。为弄清 BDNF在鸣唱控制系统内的作用时间和位点，Tang等对两性斑胸草雀鸣唱控制核团内BDNF的表达情况进行了详细研究。

　　研究涉及幼鸟发育的四个时期(孵化后第25、35、45和65天)及成年期。研究表明，雄鸟 HVC 和 RA 中的 BDNF 免疫阳性细胞数量显著多于雌鸟。与雌鸟孵化25 天后 HVC 中 BDNF 标记逐渐减少的情况 (孵化后 35 天仅见零星标记) 相比，雄鸟孵化后25～45 天，HVC 中的 BDNF 免疫阳性细胞数量稳定，而 45 天后至成年期，其数量明显增加。该时间段恰是感觉运动整合的后期，提示 BDNF 在鸣曲的形成过程中可能起重要作用。另外，雄鸟 HVC 中 BDNF 与 proBDNF 的比值在成年后显著高于发育期。HVC中proBDNF 的含量在发育期和成年后相似，而成年后 BDNF 含量显著提高。proBDNF 是BDNF的前体，由其裂解生成BDNF。proBDNF在脑中的作用恰与BDNF相反，其通过与p75泛神经营养因子受体(p75 pan-neurotrophin receptor，p75NTR)结合，促进细胞死亡，并抑制神经元迁徙[7]。BDNF 和 proBDNF 的相对表达受神经活动调节。有报道显示，高频刺激可增加大鼠海马细胞BDNF的分泌，而低频刺激则增加proBDNF的分泌。对于斑胸草雀，BDNF与proBDNF的比值随发育期的变化仅见于雄鸟HVC中。

　　因此，这种BDNF与proBDNF比值的特异性增加，可能由鸣唱行为引起的HVC神经元活动所导致，也许在鸣曲形成及HVC结构变化的过程中起重要作用。在RA中，雄鸟BDNF免疫阳性细胞数量在发育期稳定增加，孵化后65天达到峰值，之后至成年期有所下降。而雌鸟RA内的BDNF免疫阳性细胞则随着发育逐渐减少。在LMAN和X区，雄鸟孵化后25天直至成年期，BDNF的表达水平相对稳定。

　　雌鸟LMAN内的 BDNF 标记细胞仅见于孵化后第 25 天组，而 X 区内各期均未见 BDNF 标记。另有研究结果显示，孵化后 20 天，BDNF 的表达仅见于雄鸟 HVC。孵化后 45 天，HVC 中 BDNF的表达量达最高，同时，HVC 至 RA 的投射纤维及 RA 中也可见到 BDNF 的表达。原位杂交和逆行标记的结果也显示，孵化后 30～35 天，BDNF mRNA 的表达仅限于雄鸟 HVC，且有 35%的 HVCRA投射神经元表达 BDNF mRNA。继 HVC 之后，RA、X 区和 LMAN 于孵化后 65 天出现 BDNF 表达，直至成年期后，各区 BDNF 表达量急剧降低。

　　虽然上述研究结果存在一定差异(可能和当时的标记识别技术有关)，但仍可以推断，BDNF 的表达与鸣唱控制系统发育及鸣唱行为密切相关 (图 2)，且 HVC 可能是鸣唱控制系统中 BDNF 的主要来源，RA 中的 BDNF 可通过 HVC 顺行轴浆运输获得，而 LMAN 和 X区也可通过顺行或逆行运输的方式相继获得 BDNF。

　

　　BDNF受体 trkB 在鸣唱控制系统内的表达分布原肌球蛋白受体激酶B(tropomyosin receptor kinase B，trkB)是BDNF 的高亲和力受体，介导了BDNF 在神经系统中的作用。研究显示，trkB mRNA 在孵化后 30～35 天的两性斑胸草雀幼鸟RA、HVC 和 LMAN 中均有表达，但雄性幼鸟脑中 trkB mRNA 的表达量显著高于雌性幼鸟，且此时HVCRA投射神经元只有极少数表达trkB mRNA，而45%～62%的LMANRA投射神经元表达trkB mRNA。

　　另外，在孵化后第六天(鸣唱控制系统正处于性别分化过程)，HVC中trkB mRNA的表达量明显高于周边其它脑区。Wade对两性斑胸草雀幼鸟发育期(孵化后第3、15、30、45和60天)trkB的表达情况进行了详细研究。实验结果显示，trkB免疫阳性细胞出现在发育期HVC和RA中。HVC中trkB标记最明显，胞体和纤维均有标记。

　　雄鸟HVC在孵化后30～60天出现trkB标记，而雌鸟HVC在孵化后45～60天出现trkB标记。虽然雄鸟和雌鸟HVC在发育期的胞体标记密度大致相当，但由于雄鸟HVC体积在孵化后60天约为雌鸟的六倍，因此，雄鸟HVC中trkB免疫阳性细胞数远多于雌鸟。在孵化后30～60天，雄鸟RA胞体和纤维出现trkB标记，而雌鸟RA中未见标记。以上结果表明，BDNF受体trkB在鸟类前脑HVC-RA通路中的表达具有明显的性别二态性。BDNF与性激素在鸣唱行为调控中的相互作用。

　　在鸣唱行为只限于雄性的鸟类中，雄鸟鸣唱控制系统的发育远比雌鸟完善，例如斑胸草雀、金丝雀 (canary) 等，雄鸟 HVC 和 RA 在核团体积、细胞数量及胞体面积上均大于雌鸟。雄鸟 X 区和 LMAN 也更大更明显，而雌鸟 X 区和 LMAN 则很难鉴别。在雌雄两性均可鸣唱的鸟类，两性鸣唱控制核团之间则不存在显著差异。鸣唱控制系统及鸣唱行为的性别二态性受性激素水平调控。

　　性激素对幼鸟鸣唱控制系统发育、成鸟鸣唱控制系统可塑性及鸣曲的形成与维持均有重要作用，并可影响 HVC 中血管内皮细胞分裂和新生神经元募集。雄激素受体在鸣唱控制系统 HVC、RA、LMAN、X 区、nXIIts 以及鸣肌中均有表达，而雌激素受体仅表达于 HVC。研究表明，雄、雌激素均对鸣唱控制系统及鸣唱行为有重要影响，且 BDNF 参与了性激素对鸣唱控制系统及鸣唱行为的调控作用。

　　鸣禽成年后，不断有新生神经元加入 HVC，且这些新生神经元大多为 HVCRA投射神经元以往研究表明，HVC 中新生神经元的存活，受雄激素睾酮及其代谢物双氢睾酮和雌二醇水平的影响，并与 BDNF 的作用有关。Rasika等通过对金丝雀的研究发现，在睾酮作用下，成年雌鸟 HVC 中 BDNF 的蛋白表达量提升。成年雌鸟经睾酮处理，或在 HVC 中注入 BDNF，均可使其中的新生神经元数量显著增加。由睾酮诱导的新生神经元增加，可被 BDNF 中和抗体阻断。因此，雄激素对 HVC 的作用很可能通过 BDNF 介导。另有实验表明，成年雄性金丝雀鸣唱组HVC中BDNF mRNA的表达量增加了200%，蛋白表达量增加了30% (与非鸣唱组相比)。这种鸣唱相关的BDNF 表达，主要发生在 HVCRA投射神经元，并与单位时间的鸣唱数量成正比。

　　对新生神经元标记的结果表明，鸣唱组HVC内新生神经元的存活数量明显高于非鸣唱组[16]。据此推测，由雄激素或鸣唱行为引起的 BDNF 表达量提升，对促进HVC内新生神经元的存活和HVC-RA通路突触的形成具有重要作用。
已有研究表明，成年雌性金丝雀经睾酮处理后，可在两周内引起HVC 中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其血管内皮细胞受体VEGF-R2/Quek1/KDR 的表达上调，并最终使雌鸟的鸣唱行为、HVC 体积、HVC 神经元总数及其中新生神经元数量显著增加[18]。VEGF 及其受体的表达上调可促进血管内皮细胞分裂。实验结果显示，经睾酮处理后第三周，HVC中BDNF的表达量增加，此发生在VEGF及其受体表达上调的一周后。

　　原位杂交的结果显示，众多BDNF mRNA的表达出现于血管内皮细胞。在体注射VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，可充分减少HVC中血管内皮细胞的形成和新生神经元的数量。此外，如在埋植睾酮的同时注射 VEGF 受体酪氨酸激酶抑制剂，可充分抑制由睾酮引起的雌鸟鸣唱行为和新生神经元募集，但对HVC体积和神经元总数没有影响。

　　通过质粒转染增加HVC中BDNF的表达，可逆转VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂的作用，即增加新生神经元数量，并最终发展形成类似雄鸟的鸣唱行为。因此推测，雄激素可诱导成年鸟脑HVC中VEGF及其受体的表达上调，进而通过VEGF介导血管内皮细胞的分裂并产生BDNF，最终引起新生神经元募集。

　　雌二醇作为睾酮经芳香化作用的产物，在鸣唱控制系统可塑性和鸣唱行为调控中起重要作用。Fusani 等研究发现，通过施加芳香酶抑制剂fadrozole 阻断雄激素向雌激素转化，可改变睾酮诱导的成年雌性金丝雀鸣唱行为，并抑制 HVC 中 BDNF 的表达。在雌性斑胸草雀孵化后第三天，如经皮下埋植 17β- 雌二醇，HVC 和 RA 中 BDNF 的表达量显著提升 (孵化后第 25 天检测)，即出现 BDNF 表达的雄性化特征。而雄性幼鸟在孵化 15 天后经 17β-雌二醇处理，可在 24 小时内诱导 HVC 内 BDNF mRNA 的表达，但对 RA 和 LMAN 无效。

　　对孵化后 30～35 天的雄性幼鸟施加芳香酶抑制剂，则可充分抑制 HVC 中 BDNF mRNA 的表达。由此推断，雌激素对 HVC 中 BDNF 的表达起重要的调控作用，并进而影响 HVC投射核团的发育分化。

　　BDNF在鸣唱控制系统季节可塑性中的作用在季节性繁殖鸣禽中，鸣唱控制系统在形态学上具有明显的季节可塑性。这种可塑性与神经组织的退变有关，并受血浆雄激素调节。在繁殖季中，日照周期变长对鸟类的生理功能有显著影响。在长日照和血浆雄激素浓度升高的影响下，鸣唱控制核团体积增大，并伴随鸣唱行为增加。

　　Wissman等对成年雄性白冠雀(white-crowned sparrow)的研究结果表明，在人工模拟繁殖条件下(皮下埋植睾酮并增加光照时间)，HVC 中 BDNF mRNA 的表达水平提高；RA 中 BDNF mRNA 的表达不显著，且未受实验模拟繁殖条件的影响。进一步研究显示，如在 RA 内灌注 BDNF，可显著引起其内神经元胞体面积和密度出现繁殖季样变化。该结果提示，RA 季节性变化是由 HVC 中合成的 BDNF 蛋白通过顺行轴浆运输至其内所引起的。

　　成年雄性金丝雀HVC 中，每日都有新生神经元加入，以取代死亡的神经元。HVC 中新生神经元由侧脑室室管膜放射状细胞分裂产生。新生神经元在侧脑室壁形成后，迁移至HVC，其中只有一部分新生神经元能存活下来，并接受突触传入，最终在结构和功能上整合入HVC。

　　在一年当中，不同时间段产生新生神经元的存活时间不同。Alvarez-Borda等分别对成年雄性金丝雀五月份(春季)和十月份(秋季)两季的新生神经元进行[3H]胸腺嘧啶标记。标记后 30 天的结果显示，秋季新生神经元的存活率比春季高两倍，且秋季的标记细胞可存活八个月以上。春季新生神经元则持续死亡，至八个月后已所剩无几。在注射[3H]胸腺嘧啶后 14～20 日，如连续在 HVC 中灌注 BDNF，可使春季新生神经元的存活率提升至正常秋季新生神经元的水平。

　　若在注射[3H]胸腺嘧啶后4～10或24～30日进行BDNF灌注，则不能获得该效果。新生神经元形成后14～20日，恰逢其结束迁徙到达HVC内指定位点之时。由此推测，BDNF对新生神经元的作用可能存在敏感期。金丝雀在春季和秋季之后，均经历血睾酮含量和鸣唱数量显著下降的生理状态。

　　显然，BDNF可帮助新生神经元在敏感期内克服睾酮含量的不足，促进其长时间存活。BDNF在鸣曲形成过程中的作用斑胸草雀幼鸟在感觉运动期通过听觉反馈进行鸣唱学习，且鸣曲需在幼年特定的时期(敏感期)内习得。幼鸟通过模仿亲鸟的教习曲，并在不断尝试和练习之后，最终使自身鸣曲与教习曲达到一致。

　　在鸣唱学习过程中，鸣曲的结构由高度变化到逐渐固化。从感觉运动期结束(约在孵化后 90 天) 至整个成年期，鸣曲结构固化不变。一首鸣曲通常由若干序幕音和主题曲(motif)构成，其中，序幕音由一串重复的相同音节组成，而 motif 则由一系列不同的音节有序排列而成。一般每个 motif 包含 2～8 个音节。

　　VMP对鸣曲可变性的调控在幼鸟鸣曲学习和成鸟鸣曲维持中起重要作用。在 VMP 中，HVC 控制着鸣曲的音节顺序和时间模式，并通过轴突依次激活 RA 内的神经元群，将音节顺序指令传达至 RA。RA则在接受 HVC 的指令后，对每个音节的结构特征进行调控，并最终产生并输出一系列信号至脑干发声控制区。研究证实，HVC 中神经元至少包含HVCRA投射神经元、HVCX投射神经元和中间神经元三种类型，其中两类投射神经元的脉冲发放与音节顺序有严格的时间对应关系[27]。RA 中神经元接受来自 HVCRA投射神经元的兴奋性传入。在抑制性中间神经元的调控下，相互联系的投射神经元群可产生同步化发放。

　　RA内神经元发放模式的变化与鸣曲中音节的音调、振幅等声学特征变化显著相关。RA还通过 LMAN 与 AFP 相联系。LMAN 的突触传入对 RA 活动具有重要影响。研究表明，电损毁斑胸草雀幼鸟 LMAN 后，将 BDNF 通过压力直接注入 RA 内，可抑制因去除 LMAN突触传入所引起的 RA 内细胞凋亡。因此提示，BDNF 在 HVC-RA 和 LMAN-RA 通路对鸣唱行为的调控中起重要作用。

　　在鸣唱学习的感觉运动期，鸣禽幼鸟的鸣曲常常不能与教习曲达到完美匹配。

　　Dittrich 等将载有BDNF 基因的质粒，分别转染至幼年雄性斑胸草雀 HVC、RA 和 X 区内表达。结果显示，HVC 中 BDNF mRNA 表达量的短暂提升，可显著提高幼鸟鸣曲与教习曲的匹配度，促进鸣曲习得。如将 BDNF 转染于 RA 或 X 区，则未能获得类似效果。该研究表明，在鸣唱学习的感觉运动期，HVC 内 BDNF 的表达可能对鸣曲形成起促进作用。

　　经研究发现，在鸣曲结构已固化的成年斑胸草雀RA 内注入 BDNF 包被的荧光胶乳微球，可使已高度稳定的鸣曲序列发生可逆性改变。实验表明，注入BDNF后的1～7天，虽然鸣曲中音节的顺序未变，但其中部分音节的呈现时有时无，鸣曲结构高度变化。

　　这种由外源性BDNF 引起的成鸟鸣曲结构变化，与正常处于感觉运动中期的幼鸟鸣曲结构高度相似。据此推测，正常成年斑胸草雀 RA 中，内源性 BDNF 的表达应处于较低水平，以此保证鸣曲结构的高度稳定。由 BDNF 引起的去稳定化的鸣曲结构，在一周后重新固化，但重新固化的鸣曲音节数量减少，原有的一个或多个音节被删除，且删除音节与相邻音节之间的时间间隔缩短，表明鸣曲结构的改变并非只是音节丢失，还应包括对音节丢失后间隔时间的重新调整。如前所述，音节序列的时间模式应由 HVC 控制。因此，RA 内外源性引入BDNF对成鸟鸣唱行为的影响，应不仅仅局限于RA核团内部，很可能通过逆向轴浆运输，同时对HVC产生作用。

　　形态学的实验结果证实，BDNF注入后，伴随着鸣曲结构的改变，HVC-RA通路突触数量显著增加，为上述假设提供了有力支持。根据以上实验结果，我们推测在感觉运动期内，幼鸟RA内BDNF的高水平表达，对发育过程中HVC-RA通路突触形成和鸣唱学习具有重要促进作用。

　　外源性BDNF可能通过增加HVC-RA通路突触数量和/或突触传递效能而引起鸣曲结构改变。鸣曲结构的改变和突触数量的增加，必然伴随HVC-RA通路电生理特性的变化。这种电生理特性的变化可能是BDNF参与HVC-RA通路对鸣唱行为调控作用的重要机制，对此还有待深入探索(图3为我们提出的科学假设)。

　

　　展 望

　　综上所述，BDNF 在鸟类鸣唱学习和鸣曲维持过程中起关键作用，尤其在发声运动HVC-RA 通路对鸣唱行为的调控中扮演重要角色。目前，国内外关于 BDNF 对鸟类鸣唱调控作用的研究主要集中在BDNF 影响新生神经元募集及存活、性激素及性别二态性、鸣唱控制系统季节可塑性和鸣唱行为等方面。虽然已经取得了一批重要的理论成果，但对很多科学问题仍有待进一步研究。借助神经电生理学、药理学、生物化学与分子生物学等技术手段，我们可以更清楚地认识BDNF 与鸟类鸣唱行为的关系，同时可为我们认识神经活动与运动程序编码及脑与行为的关系，乃至人类语言学习和某些神经系统疾病提供重要借鉴。