单胺氧化酶B与外周神经系统的关系探究

　　单胺氧化酶（MAO）是一种降解生物肽的酶[1],分为两种亚型，单胺氧化酶A（MAOA）和单胺氧化酶B（MAOB）[2].

　　MAO-A对底物血清素（5-HT）、去甲肾上腺素 （NE）、多巴胺（DA）和抑制剂氯吉兰具有高度亲和性[3];单胺氧化酶B是一种线粒体黄素蛋 白酶，其 作用主要为氧化脱 氨，对苯乙基胺（PEA）、苯甲胺和抑制剂司来吉兰（deprenyl）具有高亲和性[4].MAOB主要倾向于外源性胺的新陈代谢，如2-苯基乙胺，故其对酶作用物苯基乙胺以及抑制物司来吉兰有密切关系。因此，它可以作为大脑代谢屏障限制假神经递质 进 入 中 枢 神 经 系统[5].另外，MAOB还可以代谢大脑中的多巴胺，其抑制剂通常被用来治疗帕金森病[6,7].之前研究证实，MAOB不仅存在于中枢神经系统，也存在于外周组织中，如肝脏、肾脏、脑、甲状腺等[8,9].但MAOB主要存在于淋巴细胞和血小板中。

　　目前MAOB在中枢神经系统和外周器官的分布已经研究到了细胞甚至亚细胞水平，在外周神经系统的细胞及亚细胞的研究较少。在我们的研究中，通过免疫组化的方法确定大鼠外周神经系统MAOB存在，从而进一步探索MAOB与外周神经系统的关系。

　　1材料与方法
　　
　　1.1动物
　　
　　清洁级正常健康雄性SD大鼠6只，体重180-200g,购自吉林大学实验动物中心。所有实验过程遵循吉林大学动物实验原则，将大鼠使用数量及承受痛苦降到最低。为大鼠提供标准的食物和自来水。

　　1.2初级抗体
　　
　　MAOB起初是从牛的肝脏线粒体中提纯而来，用于制备兔抗MAOB抗血清[10].在大鼠的脑中，这种抗血清可以通过免疫组化法将含有MAOB的细胞染色，而含有MAOA的细胞不着色。即这种抗血清特定的识别大鼠体内的MAOB.

　　1.3免疫组化方法-低倍镜
　　
　　根据之前的研究[11],低倍镜下观察的MAOB的分布其免疫组化染色通常使用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物。

　　取3只大鼠，腹腔注射 戊 巴 比 妥 钠 （60 mg/kg），待大鼠麻醉后，打开胸腔，左心室插管至升主动脉，先用pH7.4 0.01M磷酸缓冲液50ml室温下冲洗，然后用含有4%多聚甲醛、0.3%戊二醛和0.2%苦味酸的4℃ 0.1M的磷酸缓冲液300ml灌注固定。灌毕后，立即取出大鼠舌体，将舌体再置入上述固定液中固定24h.将舌体于低温培养箱中30μm冠状切成切片，按 以下程 序培养：

　　①含 有0.3%聚乙二醇辛基苯基醚的磷酸缓冲液（PBS）中室温培养1h;②含兔抗MAOB抗血清的PBS（1∶200 00）中4℃培养60h;③于生物素化的羊抗兔免疫球蛋白G（1∶1 000）中室温培养2h;④于亲和素-生物素-过氧化物酶复合物中室温培养2h;⑤含有0.025%3,3-二氨基联苯胺、0.6%硫酸镍按和0.006%过氧化氢的0.05 M的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（TRIS-HCl）缓冲液中室温培养2min.待培养完成后，将标本用含有1%四氧化锇的0.1M的磷酸缓冲液4℃固定1h,环氧树脂脱水包埋。置于光镜下观察其染色。

　　1.4免疫组化方法-高倍镜
　　
　　同样取3只 大 鼠，腹 腔 注 射 戊 巴 比 妥 钠 （60mg/kg），待大鼠麻醉后，打开胸腔，左心室插管至升主动脉，先用pH 7.4 0.01M磷酸缓冲液50ml室温下冲洗，然后用含有4%多聚甲醛、0.3%戊二醛和0.2%苦味酸的4℃ 0.1M的磷酸缓冲液300ml灌注固定。灌毕后，立即取出大鼠舌体，将舌体再置入上述固定液中固定24h.固定后，将舌体用显微用切片机50μm冠状切成切片，并保存于0.1M的磷酸缓冲液中。

　　我们采用免疫酶法用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物对MAOB进行染色。染色方法如下：

　　①含有0.001%胰蛋白酶（Ⅲ型）的磷酸缓冲液室温下5min;②含有5%羊血清的磷酸盐缓冲液室温下1h;③兔抗MAOB抗血清（1∶60 000）混合1%的正常羊血清4℃下48h;④于生物素化的羊抗兔免疫球蛋白G（1∶1 000）中室温培养2h;⑤于亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（1∶1 000）中室温培养2h;⑥含有0.025%3,3-二氨基联苯胺、0.6%硫酸镍按和0.006%过氧化氢的0.05M的三羟甲基氨基甲烷 盐 酸 盐 （TRIS-HCl）缓 冲 液 中 室 温 培 养10min.待培养完成后，将标本用含有1%四氧化锇的0.1M的磷酸缓冲液4℃固定1h,环氧树脂脱水包埋，用超微切片机切片。切片用乙酸双氧铀和铅染色溶液染色，置于透射电镜下观察。

　　2结果
　　
　　2.1免疫组化-低倍镜
　　
　　低倍镜下，在大鼠舌头的固有层中及上皮层中发现MAOB免疫阳性区，反应阳性区域成暗黑色（图1）。

　　2.2免疫组化-高倍镜
　　
　　电镜下，我们发现有髓鞘轴突（图2A）和无髓鞘轴突（图3A）中存在MAOB免疫阳性区域。同时有髓鞘轴突的周边的施万细胞中也存在MAOB阳性区域（图2B）。在MAOB阳性结构中，我们发现MAOB免疫阳性物质存在于轴突的线粒体外膜及其周围。此外，并非所有的轴突线粒体外膜都呈阳性反应，部分有髓鞘轴突（图2B）、无髓鞘轴突（图3B）和施万细胞（图3C）中的线粒体外膜成免疫阴性。

　　3讨论
　　
　　根据目前的研究，我们通过使用免疫组织化学的方法研究了一定数量的有髓鞘轴突和无髓鞘轴突。在电镜下，有髓鞘纤维轴突及无髓鞘神经纤维轴突中发现了大量的单胺氧化酶B阳性区域。阳性区域位于轴突内线粒体外膜及其周围。这就提出一个问题，是否MAOB不仅存在于线粒体外膜上而且还存在于线粒体外膜的周围。

　　MAOB免疫组化阳性区域为二氨基联苯胺的氧化产物，通过亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法用过氧化物酶催化形成[12].在免疫组化使用过氧化物酶于电镜观察时，二氨基联苯胺的氧化产物可以从原来抗原的位点上展开。此外，之前研究已经在大鼠肠嗜铬细胞证实MAOB显着存在于线粒体外膜上。因此，MAOB主要是位于线粒体外膜上。

　　同时在有髓鞘和无髓鞘轴突中我们还发现并不是所有的线粒体呈现阳性特征。有的线粒体表面呈阳性表现，有一部分线粒体却成阴性表现。即一部分线粒体外膜上含有MAOB,另一部分线粒体外膜上没有这种酶。这种发现可能归因于一种或者更多的原因：

　　①人为造成，切片将该区域破坏；②不均匀的固定破坏了线粒体外膜上酶的活性；③部分线粒体自身就缺少这种酶[13].MAOB的基因在人和鼠中都位于X染色体上，在大鼠中MAOB编码在核基因，在细胞质的核糖体上合成。因此，MAOB在细胞质中合成某种方式转运到线粒体外膜上，其中任何一个环节出问题都可能导致MAOB的表达障碍。弄清楚这种表现不同的确切原因还需进一步深入研究。

　　单胺氧化酶B是典型的线粒体外膜上内嵌型酶，它在含多核糖体的细胞之内合成，负责儿茶酚胺类、血清素、生物胺等单胺类神经递质氧化脱氨基作用[14].MAOB主要作用于B-苯乙胺，对选择性的抑制剂如丙炔苯丙胺敏感。在之前的研究中，已通过组织化学的方法证实了MAO存在于大鼠外周神经，即坐骨神经中，并证实了轴突外的MAO为生物胺的屏障系统。

　　MAOB可代谢胺类神经递质，神经递质功能就是传导神经冲动，神经递质正常的的合成与降解对轴突之间神经冲动的传导有着重要的作用。本研究发现MAOB在大鼠外周神经轴突大量表达，为进一步探讨MAOB与轴突运输及神经传导的关系提供了形态学依据。