基于核酸适配体的SPE技术研究新成果(3)

　　2 基于核酸适配体的固相萃取过程。
　　
　　基于核酸适配体的 SPE 过程主要是固定于载体表面的核酸适配体与目标分析物之间的结合与解离的过程。与传统的 SPE 过程相似，基于核酸适配体的 SPE 过程包括 3 个步骤：上样、淋洗和洗脱。与传统 SPE 柱不同的是，基于核酸适配体的 SPE 柱不使用时需要置于结合缓冲液中，并保存于 4 ℃冰箱。结合缓冲液是指筛选该适配体时使用的溶液，另外保存液中也常加入叠氮化钠。
　　
　　2.1 上样。
　　
　　上样环境会影响核酸适配体与样品中目标分析物的相互作用，比如温度[55]、离子强度、pH[56]等。这些因素限制了实际样品中目标分析物的直接萃取，可采用适当的溶剂将实际样品稀释，改变其离子强度和pH 等，再进行萃取和富集。
　　
　　在对固体样品中的分析物进行萃取时，往往先采用有机溶剂或者水-有机溶剂来溶解样品。样品中有机溶剂含量较高有可能会影响上样过程中核酸适配体与目标分析物的结合。多数情况下，当样品中有机成分 过 高 时，采 用 水 溶 液 稀 释 后 再 进 行 萃取[7,26,35,36].在对液体样品进行萃取时，也常稀释后再萃取，其目的是减小样品的黏度[31,43]以及降低生物样品除蛋白质后有机溶剂的比例[14,32].比如，在用基于核酸适配体的 SPE 进行样品中孔雀石绿的萃取时，当样品中甲醇体积分数超过 2% ,核酸适配体与孔雀石绿形成的复合物稳定性就开始下降[56];而在赭曲霉素 A 的萃取研究中，即使样品中的甲醇体积分数高达 10% ~15%,核酸适配体对赭曲霉素 A 的捕获效率依然不会下降[7].
　　
　　适配体与目标分析物之间的相互作用依赖于核酸适配体的分子构象，而其构象也受到很多因素的影响。一价和二价阳离子的存在可能会改变核酸适配体的构象，目前已有学者做过此方面的研究。比如富含鸟嘌呤的核酸适配体可在钾离子存在时形成 G 四联体结构[43].研究者[26]将结合缓冲液中的镁离子替换为钙离子，筛选出了对赭曲霉素 A 具有更高亲和能力的核酸适配体，并且该核酸适配体与赭曲霉素A 之间的亲和能力不会受到溶液中一价离子（钠离子、钾离子）浓度变化的影响，只要溶液中存在钙离子或镁离子，其亲和性就会存在，这个结果提示离子强度对赭曲霉素 A 与适配体之间亲和能力的影响极小。
　　
　　2.2 淋洗。
　　
　　SPE 过程中，淋洗的目的是将上样后 SPE 柱中非特异性吸附的基质去除，在此过程中，尽可能不破坏核酸适配体与目标分析物的特异性相互作用，而载体材料[14]、核苷酸[36]、间隔体[17]均会对非特异性吸附做出贡献。可采用不含有核酸适配体的对照材料（如裸露的载体、固定有随机序列单链核苷酸的材料以及包被有间隔体的载体等）进行淋洗过程的优化，并通过分析淋洗溶液中的目标分析物来确定最佳的淋洗溶剂[35,36].比如，Wu 等[36]采用固定有核酸适配体的磁性纳米颗粒作为固相萃取的吸附剂，在优化淋洗条件时，分别采用裸露的磁性纳米颗粒、固定有随机序列核苷酸的磁性纳米颗粒作为对照，优化了淋洗和洗脱的条件。
　　
　　2.3 洗脱。
　　
　　为达到洗脱目标分析物的目的，需要破坏核酸适配体与目标分析物之间的相互作用。理想的洗脱溶液可以有效破坏目标分析物-核酸适配体复合物，并且不会影响核酸适配体在吸附材料上的固定。常用的洗脱溶液有离液序列试剂（如 NaClO4）[48]、变性剂（如 尿 素、盐 酸 胍）[43]、清 除 剂 （如 乙 二 胺 四 乙酸）[26]、水-有机溶剂混合液[11,23]等，另外，提高温度[43]、改变 pH[36]等手段对目标分析物的洗脱也有帮助。洗脱方法的选取需要考虑分析物的性质以及核酸适配体的固定方式。比如，对于由共价键固定的核酸适配体固相萃取柱，可采用 60% （体积分数）的乙腈洗脱保留在柱上的可卡因；而对于由生物素-链霉亲和素固定的核酸适配体固相萃取柱，只能采用10% （体积分数）的乙腈对目标分析物进行洗脱，过高的有机溶剂比例会破坏核酸适配体的固定；对于后者，可通过升温至 60 ℃来提高低有机溶剂比例洗脱液的洗脱能力[14].
　　
　　3 目标分析物的检测方法。
　　
　　SPE 得到的目标分析物可以通过离线[11]或在线[10]的方式与其他分析方法联用进行检测。常用的检测手段有 LC-UV[12]、液相色谱-激光诱导荧光检测（LC-LIF）[7,11,36]、LC-MS[18]、GC-MS[4,30]、MS[47,57]等，这里不作赘述。
　　
　　4 应用。
　　
　　4.1 小分子。
　　
　　近几年，已经有很多基于核酸适配体的 SPE 方法用于多种样品中小分子的萃取，比如人血浆中腺苷[18,31]、可卡因[12,14,33,34]以及四环素[32]的萃取。其中在可卡因萃取之前，需要先使用结合缓冲液稀释样品[12];而对于四环素的萃取，则需要先去除样品中的蛋白质[32].研究最多的小分子是赭曲霉素 A[37],文献报道了多种样品中赭曲霉素 A 的萃取，比如小麦提取物[7,23,26]、姜 粉 提 取 物[35]和 红 酒[11]等。Lin等[4]将核酸适配体固定于富含有机金属骨架的SPME 纤维表面，对鱼肉样品中的多氯联苯进行了选择性萃取富集，并结合 GC-MS 建立了鱼肉中多氯联苯的检测方法，该方法的检出限可达 0. 003 μg/ L.
　　
　　4.2 大分子。
　　
　　基于核酸适配体的 SPE 柱萃取样品中的大分子也有少数报道。比如培养基中 L-selectin 蛋白质的萃取[28],血液中的 β1-受体的清除[45],大肠杆菌溶解产物中组氨酸标记白的净化[46],血清[39,41,57]、血浆[44]以及血液[58]中凝血酶的萃取等。
　　
　　5 总结与展望。
　　
　　目前已经开发了很多基于核酸适配体的 SPE 材料及装置，由于核酸适配体对目标分析物的高亲和性和高特异性，基于核酸适配体的 SPE 技术在复杂样品中痕量组分的选择性萃取、分离、纯化和富集中展现出巨大的应用潜力。当然基于核酸适配体的 SPE技术的发展也有一定局限，比如目前已筛选出的核酸适配体数量有限、大规模生产核酸适配体的费用太高、核酸适配体自身稳定性不够等。针对以上问题，基于核酸适配体的固相萃取技术的发展趋势有以下两方面。