大肠杆菌中抗菌肽的融合表达

　　摘    要：　抗菌肽抗菌谱广、活性稳定, 具有与抗生素不同的抗菌机制, 在抑杀病原微生物的同时不易产生耐药性, 在免疫调节和抗感染方面具有巨大的发展潜力, 能够发展为取代抗生素的新型药剂, 在食品、饲料、畜禽养殖等领域也具有重要的应用价值。基因工程技术是降低抗菌肽生产成本的主要方式, 其中融合表达在提高抗菌肽产量方面起到了重要作用。综述了抗菌肽在大肠杆菌中融合表达的国内外研究进展, 探讨了抗菌肽在大肠杆菌中融合表达的策略, 并对高通量融合表达抗菌肽提出了建议。

　　关键词：　抗菌肽; 大肠杆菌; 基因工程; 融合表达; 高通量;

　　Abstract：　Antimicrobial peptides have a wide antimicrobial spectrum and stable activity, with different antibacterial mechanisms from antibiotics, they result in a higher efficacy against pathogens. At the same time, they're difficult to form drug resistance. Antimicrobial peptides have great development potential in immune regulation and anti-infection, so they're able to develop new agents, to replace antibiotics. Besides, they have immense applied value in food, forage, poultry breeding and so on. Genetic engineering is the main way to reduce the production costs in antimicrobial peptides, furthermore, the fusion expression plays a important role in improving production. In this paper, we summarized the research progress of antimicrobial peptides' fusion expression in E. coli, at home and abroad. Also, the fusion strategy in E. coli are discussed, and we proposed our own view on the high flux fusion expression of antimicrobial peptides.

　　Keyword：　antimicrobial peptides; Escherichia coli; genetic engineering; fusion expression; high-throughput;

　　真菌、细菌对抗生素的耐药性引起了全世界范围的普遍担忧, 导致巨大的财力、物力花费在寻找新型抗生素上, 但效果甚微[1]。一些抗生素对普通的感染作用效果差, 引起大众对不可治愈的恐慌[2]。现在大量的研究者从事于抗生素的耐药性机理的研究, 但是由于缺乏协调行动, 进展非常缓慢[3]。目前的形势需要开发出抗生素的替代品。

　　抗菌肽是动物、植物等生物体免疫系统防御外来真菌、细菌等病原微生物入侵而合成的一类小分子多肽类物质[4,5]。抗菌肽一般由10~60个氨基酸组成, 其中接近一半是亲水性氨基酸, 带有一定量的正电荷, 能够直接攻击或破坏细菌、真菌的细胞膜或病毒的包膜。不同于抗生素作用于酶或DNA, 抗菌肽能够阻碍产生耐药性, 并且对热稳定, 一些抗菌肽100℃加热10 min仍有活性, 有较宽的p H耐受范围[6]。加热抗菌肽抗菌谱广, 活性稳定, 并且不会对人及其所生存的环境产生危害, 绿色环保。基于这些优点, 激发了广大科研人员的兴趣, 科研人员已经对抗菌肽的作用机制、安全性进行了深入研究, 并且提供了抗菌肽在线更新数据库 (APD, http://aps.unmc edu/AP/) 服务[6,7]。已经有2 000多种抗菌肽被分离出来[8], 其中, 部分已经用于医药、食品及畜禽水产养殖等领域[9]。

　　尽管在抗菌肽的研究领域已经取得丰硕的成果, 但由于生产成本居高不下, 难以投入工业化生产和商业化运营。大量高纯度的抗菌肽是开展基础研究及临床实验的关键。天然来源的抗菌肽资源有限、纯化困难, 化学合成抗菌肽成本高、活性不稳定, 因此通过基因重组来表达得到大量抗菌肽是低成本、高效益的方法[10]。

　　1 、抗菌肽表达系统

　　1.1、 昆虫表达系统

　　广泛使用的真核表达系统, 赵昆等[11]实现牛抗菌肽Bac7-Bac5-βdefense串联基因在昆虫杆状病毒系统中的表达。昆虫具有一般真核生物翻译后修饰的功能, 且表达水平高, 成本低, 但是翻译后加工修饰操作繁琐。
 

　　1.2、 毕赤酵母表达系统

　　另一个常用的真核表达系统为毕赤酵母。同昆虫一样具有完备的翻译后修饰的功能, 目前已经实现了多种抗菌肽在其中的表达, 如孙立人等[12]试验斑点叉尾鮰LEAP-2抗菌肽在毕赤酵母中的表达, 随着发酵时间的延长, 表达产量在上升, 当发酵培养120 h后产量达到2.7 mg/L (最高值) 。Farzana等[13]利用p PIC9K表达载体实现了人类抗菌肽hpcidin在毕赤酵母中的分泌表达及纯化和功能验证, 并且表达量稳定在3 mg/L。毕赤酵母中存在表达水平低, 发酵周期长, 易污染等问题[14]。

　　1.3、 大肠杆菌表达系统

　　大肠杆菌遗传图谱清楚, 易培养, 周期短, 对许多蛋白质都有一定的耐受能力, 在较短的时间内可以高水平地表达多种蛋白, 发酵条件易掌控, 但是缺乏像酵母等真核系统翻译后修饰加工功能, 所表达的产物生物活性较低[15]。然而抗菌肽都是一些小肽类分子, 不需要翻译后修饰等过程, 因此大肠杆菌是抗菌肽首选的表达系统。

　　2、 抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达

　　抗菌肽分子小, 直接表达不仅对宿主具有毒杀作用, 而且极易被一些蛋白酶水解, 因此难以获得具有天然活性的抗菌肽。为了解决这个问题, 目前普遍采用的是在抗菌肽的N端接入一个可以在大肠杆菌中表达的蛋白质, 进行融合表达, 然后通过化学试剂处理或添加酶处理除去载体蛋白, 进一步分离提纯, 就可以获得高产的抗菌肽[16]。

　　2.1 、融合蛋白标签

　　载体蛋白的功能是避免抗菌肽被蛋白酶降解和对宿主产生毒杀作用, 现在抗菌肽在大肠杆菌的融合表达的主要载体蛋白可以分为四大类:增强可溶性的融合标签, 促进包涵体形成的融合标签, 可自我剪切的融合标签, 信号肽类的融合标签[17]。本文综述了一些常用的融合标签及其表达策略。

　　2.1.1、 增强可溶性的融合标签

　　1) 谷胱甘肽转移酶 (GST) 融合标签。GST可以在大肠杆菌融合表达中稳定存在, 可以迅速通过固定了谷胱甘肽的色谱柱从溶菌后的混合液中分离, 非变性的条件下10 mmol/L的还原型谷胱甘肽洗脱获得GST—抗菌肽融合蛋白[18]。融合蛋白通过位点专一的蛋白酶如凝血酶或Xa-因子切除GST部分, 获得目的蛋白。欧阳萍等[19]将人溶菌酶和抗菌肽tachyplesins融合基因克隆至带有GST标签的原核表达载体p GEX-4T-1上, 转化大肠杆菌BL21 (DE3) , IPTG诱导表达, 并对表达条件进行优化, 纯化融合蛋白纯度达90%。由于GST标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解, 提高其稳定性、可溶性, 并且通过亲和层析简化后续的纯化工作, 所以抗菌肽同GST标签融合表达将显着提高其表达量、降低生产成本。但是由于GST融合标签过大 (27KD) , 而抗菌肽分子小, 二者相比质量差距大, GST会影响抗菌肽的表达产量[20]。

　　2) 硫氧还蛋白 (thioredoxin) 融合标签。硫氧还蛋白是比GST更常用的融合表达标签, 分子量为17KD, 不仅可以避免重组蛋白被蛋白酶降解, 还可以促进重组蛋白内二硫键的形成, 加工成更高稳定的结构[21]。硫氧还蛋白没有专门的亲和介质可以用于分离提纯, 因此在抗菌肽融合表达时, 需要与一些亲和标签进行联合。Alem等[22]利用硫氧还蛋白融合标签和His亲和标签在大肠杆菌系统中成功融合表达并分离得到了来自青苋中的Aq抗菌肽, 表达产量为38 mg/L。Krahulec等[23]成功融合表达了Trx—LL—37融合蛋白, 1 g融合蛋白/每升培养液, 最终高效液相色谱检测纯化的人源抗菌肽LL37的含量为37 mg/L, 功能检测显示对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有很好的抑菌活性。Gagliardo等[24]在融合表达铁调素 (一种肝抗菌肽) 时验证, 采用硫氧还蛋白作为融合蛋白标签时应该采用低温诱导的方式发酵, 这样能够协助抗菌肽的可溶性表达。

　　3) 小分子泛素样修饰蛋白 (SUMO) 融合标签。SUMO大约由100个氨基酸组成, 类似于泛素但功能完全不同, 是新发展起来的一类融合表达标签。SUMO可以用于难以表达的蛋白质的融合表达, 可抗蛋白酶水解, 引导目标蛋白的正确折叠, 增强融合蛋白的可溶性[25]。LI等[26]成功融合表达了SUMO—CM4, NI柱亲和层析获得每升112 mg的融合蛋白, 经SUMO蛋白酶处理后, 可以获得24 mg/L的CM4, 功能检测同天然CM4抗菌肽一样具有良好的抑菌活性。由于SUMO蛋白酶用于分离提纯, 使得融合表达的成本升高, 限制了SUMO的应用, 姜媛媛等[27]设计了高效可溶性表达重组蛋白的载体, 即His-SUMO和目的序列之间加入羟胺切割位点在His—SUMO中表达的融合蛋白用Ni-NTA纯化, 羟胺液切割后可获得仅留一个甘氨酸残基的重组蛋白。

　　2.1.2 、促进包涵体形成的融合标签

　　蛋白质除了使用增强可溶性的蛋白标签实现高效表达, 后通过亲和纯化, 切除融合蛋白标签而获得蛋白质, 也可以使目标蛋白质积聚在包涵体内进行表达。这种表达策略也应用到了抗菌肽领域, 包涵体表达抗菌肽能够保护抗菌肽被蛋白酶降解。在这一类抗菌肽融合标签中主要有类固醇异构酶、Purf片段、Pa Per3.30、TAF12组蛋白[28]。Kim等[29]利用Pur F片段实现了抗菌肽histonin包涵体形式的高表达, 在其表达系统内, 可以获得167 mg/L大肠杆菌发酵液。

　　为了获得抗菌肽单品, 需要收集包涵体, 可能会破碎细胞壁, 细胞内容物流出影响分离纯化, 需要经历变性、复性等过程, 操作繁琐, 并且收率较低, 因此目前多使用可溶性表达, 较少考虑包涵体形式表达。

　　2.1.3 、可自行切割的融合标签

　　内含肽是前体未成熟的蛋白质中一条多肽链, 又称作内含子蛋白质, 可以通过内含肽的自我剪接作用使得蛋白质结构发生重排, 也利用内含肽的这一作用开发出众多的亲和纯化系统, 较其他的亲和纯化标签简单, 通过改变温度、p H或加入如巯基乙醇类化学试剂即可体外自我剪接, 获得除去融合蛋白标签的抗菌肽[30,31,32]。Coolbaugh等[33]利用几丁质结合结构域 (CBD) 亲和标签和基于弹性蛋白样多肽亲和标签 (ELP) 实现了β半乳糖苷酶和超折叠绿色荧光蛋白的高通量表达纯化。Xie等[34]利用内含肽融合表达系统, 实现了OG—2的高产量表达, 是目前最好的高产量内含肽融合表达系统。

　　2.1.4、 信号肽类的融合标签

　　信号肽能够引导蛋白质正常折叠, 在分泌表达时常引入信号肽增强分泌表达, 表达后, 信号肽会被切除, 原保留在蛋白质N端的甲硫氨酸也会切除, 这样的蛋白质不用因为具备免疫原性而需要再切除。大肠杆菌中常用的信号肽有Omp A、Pel B、Pho A、Hly A、cherry等[35]。Lee等[36]用Omp A实现了扁口鱼铁调素Ⅰ的可溶性表达。这一类融合标签目前用的很少。

　　2.2、 亲和纯化标签

　　上述提到的GST、内含肽等融合蛋白标签自身可以作为亲和介质作用的亲和标签。另一个重要的标签是聚组氨酸标签。组氨酸标签是大肠杆菌表达重组蛋白纯化中最常使用的亲和纯化标签, 可以与装载有Ni的亲和柱子结合[37]。组氨酸标签很小, 不移除不影响蛋白质的结构, 但是在一些情况有可能会影响蛋白质的溶解性及其功能[38]。张亚妮等[39]实现人工合成抗菌肽D2A21基因的克隆和表达, 其中直接应用His6表达和纯化抗菌肽D2A21。Yi等[40构建His6—SUMO—A20L融合表达体系, 成功表达了抗菌肽A20L, 最高纯化后产量为5.3 mg/L, 表达的抗菌肽A20L抗多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。组氨酸标签用于抗菌肽的分离纯化, 简单易行, 是设计并构建抗菌肽表达系统的首要选择。

　　2.3、 融合蛋白标签的切除

　　融合蛋白标签的存在可能会影响目标蛋白的结构和功能, 为了获得具有正确结构和良好生物活性的目标蛋白质产物, 需要采取一定的方法除去标签, 排除标签对蛋白质的影响[41]。

　　目前在抗菌肽融合表达领域蛋白融合标签的切除有3种方法, 即化学法、酶法和内含肽的自我剪接等。

　　2.3.1、 化学法

　　化学法是利用一些氨基酸之间的肽键对某些化学试剂敏感而发生断裂从而去除融合蛋白标签的一种方法。Pane等[42]构建来自人凝血酶C端的一段小的GKY20抗菌肽和豹蛙酶系列大肠杆菌融合表达, 探索了化学法切除融合蛋白的反应条件和效率, 成功构建了能够利用稀醋酸等稀酸断裂Asp—Cys之间的肽键和溴化氰断裂与甲硫氨酸相连的肽键从而除去融合标签, 并且表现出高达95%的切割效率。

　　化学法具有成本低、效率高等优点, 化学试剂作用效果好, 时间短, 可以缩短分离纯化的周期, 应用于工业化生产, 但是化学试剂可能会影响抗菌肽的结构和功能, 另外需要摸索适合的反应条件, 如作用温度、p H等。值得注意的是, 化学法切割融合蛋白标签会使抗菌肽上增加一个或数个氨基酸, 例如切割X—Met之间的肽键, 会使抗菌肽的N端多一个甲硫氨酸, 虽然不影响抗菌肽的结构和功能, 但是应用到人和动物体上会引起免疫排斥反应。

　　2.3.2、 酶法

　　酶法除去融合蛋白标签, 是在融合蛋白标签和目标蛋白之间插入酶识别和作用的位点。常使用的酶有TEV蛋白酶、Xa因子、肠激酶、凝血酶及SUMO蛋白酶等。常用的蛋白酶切割融合蛋白标签见表1。

　　表1 几种常用的蛋白酶切割融合蛋白标签

　　酶法去除融合蛋白标签作用效果好, 反应稳定, 但是应用成本高, 不易工业推广, 并且需要合适的酶切反应环境, 易变性失活。另外, 肠激酶、凝血酶等有第二识别和切割位点, 容易产生非特异性切割, 产生副产物, 影响抗菌肽的分离纯化, 这种非特异性的切割是不可能完全消失的, 只能通过改变反应条件, 减弱非特异性识别和切割的频率来实现。

　　蛋白酶法用于抗菌肽融合标签的切除, 可以从两个方向进行改进, 一是寻找特异性更强、酶切效率更高、制造成本更低的酶, 二是简化酶法切除的提纯工艺, 减少步骤, 降低损失, 例如上面提到的“His—SUMO—A20L”即是“标签—蛋白酶识别和切割序列—抗菌肽”的纯化体系, 操作程序简单。

　　2.3.3、 内含肽的自我剪接

　　利用内含肽的自我切割功能和对某种介质亲和的特性, 可以开发“内含肽—抗菌肽”的抗菌肽融合表达亲和纯化系统。目前内含肽数据中共发现了450多种内含肽。其中广泛应用于抗菌肽融合表达亲和纯化的有CBD (几丁质结合结构域) , 还有的是基于ELP (弹性蛋白样多肽) 的内含肽介导的纯化系统。

　　利用CBD和含有chitin (几丁质) 介质的亲和柱子结合, 可以提纯含有CBD的融合蛋白, 后加入巯基乙醇 (DTT) , 可以使得抗菌肽和CBD连接键断裂, 获得不含有任何其他片段的抗菌肽。Hong等[48利用CBD和人源抗菌肽 (MDCD—1L) 融合简单纯化获得了人源MDCD—1L。这一方法成本较低, 但是介质和配基之间的结合的稳定性和特异性较低, 结合的目标蛋白很容易从介质上脱落, 使获得融合蛋白含有杂蛋白。

　　基于弹性蛋白的内含肽介导的抗菌肽纯化系统得到广泛的应用。类弹性蛋白ELPs是一类人工合成的生物大分子, 由五肽重复序列单元VPGXG (其中X是除脯氨酸以外的任意一种氨基酸, 来源于哺乳动物的弹性蛋白序Yf JVPGVG) 组成, 具有温度诱导的反复相变特性[49]。而将与ELP融合的蛋白也有这样的特性, 因此, 可构建“ELP—内含肽—抗菌肽”的纯化系统, 当体系处于某一温度 (反转变温度) 时, ELP的结构会发生改变, 导致聚集沉淀, 与ELP相连的抗菌肽也会随之沉淀, 简单离心就可以获得ELP—内含肽—抗菌肽融合蛋白, 再改变条件就可以使得内含肽自我剪接, 抗菌肽从融合蛋白上释放。巢亦成[50]利用“ELP—内含肽—抗菌肽”融合表达纯化了抗菌肽NK—2内含肽介导的ELP纯化系统, 可以避免使用亲和树脂, 降低了纯化成本, 操作简单。

　　和化学法相比, 内含肽的自我剪接作用温和, 不会使得抗菌肽失去生物活性, 和酶法相比, 内含肽的自我剪接不用除去酶或获得纯抗菌肽而反复过柱子, 降低了纯化的投入, 操作也简单, 是大肠杆菌融合表达抗菌肽纯化的很好选择。

　　3 、小结

　　融合表达是目前抗菌肽表达的最好方式, 选择合适的表达菌株、融合蛋白标签及纯化体系是高效低成本表达抗菌肽的关键。本文综述了抗菌肽在大肠杆菌中融合表达及纯化的策略, 但是仅限于个别抗菌肽的表达纯化, 工业化推广由于产量低、过程复杂、成本高而受阻。为了高通量表达抗菌肽, 构建高产低成本的表达平台仍有很多工作要做。

　　为了实现抗菌肽高通量表达, 可以从以下方面考虑:一是应用现代分子生物学技术, 减少使用或不用酶切、酶连等传统构建表达载体的方法, 结合抗菌肽基因小、可全化学合成的特点, 应用无酶克隆先进操作技术, 高通量构建表达载体[51]。二是应用快速的转化检测手段。三是应用适合的融合蛋白标签和纯化标签, 最好是使得融合蛋白表达分泌到胞外, 为了工业化推广, 选择不用酶或者寻找更高效、低成本的酶去除融合标签的方法。

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