DsbA在大肠杆菌中与人源胰蛋白酶-1融合表达

　　胰蛋白酶( trypsin，EC 3. 4. 21. 4) 是丝氨酸蛋白酶家族的成员，是许多生物技术领域的工具酶，如动物细胞培养过程，一些蛋白酶原活化过程等。在胰岛素的生物合成过程中，通常是以胰岛素原的形式表达，然后在体外通过羧肽酶 B 与胰蛋白酶的特异性切割，转化为起作用的胰岛素，但是目前所用到的胰蛋白酶大多数是从动物( 如猪、牛、羊等)的胰腺中直接提取，在此过程中，有可能引入 供体动物携带的致病微生物，所以急需重组胰蛋白酶的合成。在人体中，主要存在两种胰蛋白酶原，即人胰蛋白酶原-1( trypsinogen-1，记为 PRSS1) 与人胰蛋白酶原-2( trypsinogen-2，记为 PRSS2) ，二者约占人体内胰液总蛋白的 19%，由于有研究报导 PRSS2 与人体的某些病理过程密切相关，所以本研究选择PRSS1 作为研究对象，PRSS1 相对分子质量约为 24kDa，含有 247 个氨基酸，其中有 10 个 Cys。在其 N端 1 ～15 位氨基酸为胰蛋白酶原表达信号肽，16 ～23 位的 8 个氨基酸残基( APFDDDDK) 是肠激酶的识别位点，也即胰蛋白酶原活化肽( Trypsinogen acti-vation peptide，TAP) ，在体内可被肠激酶切割成为具有活性的胰蛋白酶。Kiraly 等曾尝试在大肠杆菌中直接表达胰蛋白酶原，未发现有目的蛋白分泌，通过用 Met 代替信号肽后，有以包涵体形式出现的蛋白，Chen 等在研究胰蛋白酶原活化肽的功能时，也用 Met 代替信号肽，可见，信号肽对于胰蛋白酶在大肠杆菌中的表达并非必须。若直接表达胰蛋白酶，由于其能够特异性地在 Lys 与 Arg 的 C-端切割多肽，会对宿主造成很大伤害，也大大降低了目的蛋白的表达水平。本研究借鉴前人融合蛋白表达的优势，将胰蛋白酶作为融合蛋白表达。

　　二硫键形成蛋白 A ( Disulfide bond formationprotein A，DsbA) 最初是由 Bardwell 等于 1991 年发现，存在于大肠杆菌周质胞腔内，主要负责催化新生蛋白质二硫键形成。DsbA 在胞内与目标蛋白融合表达，有效地提高了目的蛋白的可溶性。

　　当然，不是所有的 DsbA 融合蛋白均能够得到可溶性的目的蛋白。人源胰蛋白酶-1 富含二硫键，且在载体 pET-39b( + ) ( Novagen) 上含有催化二硫键形成的周质蛋白酶 DsbA 的基因，我们将人源 Tryp-sin-1 的基因片段连接到 DsbA 的 C-端，利用 DsbA与 Trypsin-1 融合表达，预期促进 Trypsin-1 蛋白中二硫键的正确折叠，实现目的蛋白的可溶性表达，并利用载体 pET-39b( + ) 所携带的凝血酶的酶切位点来实现 Trypsin-1 的活化。

　　1 材料和方法

　　1. 1 材料

　　大肠杆菌 DH5α 与 BL21( DE3) 感受态及 EasyPfu DNA polymerase 购自北京全式金生物技术有限公司，载体 pET-39b( + ) 购自 Novagen，Trypsin-1 全基因为北京奥科鼎盛生物科技公司合成。各种普通限制性内切酶为大连 Takara 有限公司产品; Fast-digest 内切酶与预染标准核酸相对分子质量蛋白为Fermaentas 公司产品; 质粒小量快速抽提试剂盒购自北京原平皓生物技术有限公司; 琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒为北京博迈德科技发展有限公司产品;预染标准核酸相对分子质量为康为世纪公司; 其余试剂为国产或进口分析纯。

　　1. 2 实验方法

　　1. 2. 1 Trypsin-1 全基因密码子优化和二级结构分析

　　不同宿主对同一氨基酸有不同的密码子偏好性，同时 mRNA 编码区稳定性、外源蛋白的毒性对外源蛋白在原核中表达也有重要的影响。按照 Codon usage 网站提供的 E． coli 密码子使用频率表，对人源 trypsin-1( GenBank Accession No． NM_002769. 4) 的碱基进行优化设计，对密码子使用频率低的氨基酸进行同义突变。有文献报导 mR-NA 二级结构的稳定性对翻译起始效率起着至关重要的作用，进而影响蛋白的翻译，我们用 RNAstruc-ture 软件分析序列对应的 mRNA 的二级结构。

　　1. 2. 2 Trypsin-1 基因的扩增、克隆以及原核表达载体的构建

　　以含 Trypsin-1 基因的重组质粒 pGH-trypain-1为模板，设计引物进行 PCR 扩增，正向引物序列为5-aaaAGTACTATCGTTGGGGGCTATAACTG 反 向 引物序列为: 5-ccgCTCGAGTTATTAGCTATTGG CAG-CA。在正向引物和反向引物的两端分别引入 ScaI和 XhoI 酶切位点。PCR 产物经纯化后用 ScaI 和XhoI 30 ℃ 酶切 2 h，与同样经 ScaI 和 XhoI 酶切的pET-39b( + ) 质粒连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α 后采用菌落 PCR 法和双酶切验证法筛选阳性转化子克隆，并送测序公司进行测序确定。测序正确的阳性克隆转化子质粒 pET39b-trypsin-1，转入感受态大肠杆菌 BL21( DE3) 菌种。

　　1. 2. 3 重组 Trypsin-1 的诱导表达与 SDS-PAGE分析
　　
　　将 pET39b-trypsin-1/BL21( DE3) 重组菌接入含50 μg / mL 卡那霉素( Kan+) 的 LB 培养基中于37 ℃培养活化过夜，次日按 V( 活化菌液) ∶ V( LB 培养基) =1∶ 100 转接至新鲜的 LB 培养基中，37 ℃培养至 OD600 为 0. 6 左右，加入诱导剂 IPTG，24 ℃进行诱导，220 r/min 振荡培养 8 h。

　　取 100 mL 菌液，以 8000 r/min，在 4 ℃条件下离心 10 min 收集菌体，用溶液( 50 mmol/L Tris-HCl100 mmol / L NaCl pH = 8. 0) 洗涤菌体 3 次后，离心并重悬菌体，17% 的功率超声裂解 20 min。分别将裂解上清液、沉淀通过 SDS-PAGE 电泳分析，其中分离胶浓度为 15%，浓缩胶浓度为 5%，电泳后以考马斯亮蓝 R-250 染色，凝胶薄层扫描，分析目的蛋白表达情况。并尝试不同的发酵温度、诱导剂量、诱导时机以及装液量，确定最适宜培养条件。

　　1. 2. 4 Trypsin-1 包涵体的复性

　　离心收集到的菌体，按 1 L 发酵液所得菌体用20 mL 50 mmol / L Tris-HCl 重悬，8 000 r / min，4 ℃ 离心 5 min，洗涤 3 次，然后用 20 mL 50 mmol/L Tris-HCl 重悬混匀，冰上放置 30 min，17% 的功率超声裂解 20 min，4 ℃，12 000 r/min 离心 30 min，弃掉上清，用包涵体洗涤液( 3 mol/L 尿素，0. 6% Triton-X100，50 mmol / L Tris-HCl，4 mmol / L EDTA) 重悬沉淀，洗涤 30 min; 12 000 r/min 离心 30 min，弃掉上清，用包涵体洗涤液再洗 1 次，离心弃上清; 沉淀用5 mL 变性液( 50 mmol / L Tris-HCl，10 mol / L 尿素，40 mmol / L DTT，1 mmol / L EDTA) 充分溶解 3 h，4 ℃ ，12 000 r / min 离心 30 min，回收上清; 将复性液( 50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，10 mmol/LGSSG，5 mmol / L CaCl2) 缓慢加入到变性的蛋白溶液中，至尿素终浓度为 2 mol/L，4 ℃复性 12 h。复性完毕后，以50 mmol/LTris-HCl，5 mmol/L CaCl2缓冲液 4 ℃透析。

　　1. 2. 5 Trypsin-1 活性测定

　　Trypsin 的活性定义为以 N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯 盐 酸 盐 ( BAEE ) 为 底 物，用 pH 值 7. 8，0. 050 mol / L Tris-HCl 缓冲液配置 1. 0 mmol / L 底物溶液，光程 1 cm，反应温度 25 ℃，波长 253 nm 的条件下，OD 值递增 0. 001 min－ 1，为 1 个 BAEE 单位。

　　酶活力单位( BAEE 单位) = ΔOD/t × 1000。

　　并以市售猪胰蛋白酶( 北京索莱宝科技有限公司) 为对照: 2. 5 g 猪胰蛋白酶和 0. 2 gEDTA 溶于1 L PBS 中，不含钙和镁，含酚红，过滤除菌，－ 20 ℃保存，活性 250BAEE 单位 mg－ 1。

　　取 200 μL 复性蛋白液与 20 μL 凝血酶切割缓冲液( 10 × Buffer: 200 mmol/L Tris-HCl，pH = 8. 4，1. 5 mol / L NaCl，25 mmol / L CaCl2) 混合，加入 1 μL凝血酶，室温酶切后取 200 μL 酶切溶液测定其活性。
　　
　　2 结果

　　2. 1 Trypsin-1 基因表达质粒的构建

　　构建的重组表达质粒 pET39b-Trypsin-1，经菌落PCR［图 1a) ］和双酶切［图 1b) ］验证，得到 678 bp左右的特异性扩增条带，经测序验证，结果显示与所要构建的目的基因片段完全一致。【图1】

　　
　　2. 2 Trypsin-1 在大肠杆菌 BL21(DE3)中的表达

　　pET39b-Trypsin-1 / BL21( DE3 ) 经 IPTG 诱导的菌液裂解物与未诱导的同样菌液裂解物在 15% 的SDS-PAGE 电泳图上对照分析( 图 2 ) ，可以看到小于 55 kDa 处有 1 条明显的表达蛋白带，但是目的蛋白主要以包涵体的形式出现在沉淀中，分子质量与理论计算的相符。优化后的摇瓶发酵条件为37 ℃，220 r / min，500 mL 摇瓶中装液量为 100 mL，IPTG诱导 10 h 包涵体量达到最大，融合蛋白约占菌体总蛋白的 40%。IPTG 的浓度对蛋白表达影响较小，试验中用量为 0. 5 mmol/L。

　　2. 3 Trypsin-1 的亲和纯化

　　重组融合蛋白 DsbA 与 Trypsin1 之间含有 6XHis·Tag，其与金属 Ni 离子具有亲和作用，以 Ni-NTA 交联的琼脂糖作为层析介质，对超声裂解离心后的上清液柱上纯化，多次试验发现洗脱峰中没有目的蛋白，其中也曾尝试用更低的温度 ( 20 和16 ℃ ) 诱导表达也未发现有目的蛋白洗脱下来。说明对于人源的胰蛋白酶，单独的与 DsbA 融合表达，不能实现融合蛋白可溶性表达的目的。改用对包涵体变性和复性的方法得到目的蛋白。

　　2. 4 Trypsin-1 的活化和胰蛋白酶活力的测定

　　用紫外分光光度计测量 ΔOD253来检测融合蛋白复性后经凝血酶活化获得的胰蛋白酶活性，15%SDS-PAGE 结果分析见图 3。酶切 12 h 后，复性的融合蛋白基本被切开，活性达到最大，为 4 个 BAEE活力单位。对于市售猪胰蛋白酶，相当于 1 L 发酵液获得有 1. 6 mg 有活性的目的蛋白。
　　
　　2. 5 重组基因表达的 mRNA 二级结构软件分析结果

　　用 RNAstructure 软件分析了经过密码子优化后重组基因对应的 mRNA 的二级结构，图 4 优化后在翻译起始部位的碱基配对比优化前明显减少了，这样有利于翻译效率的提高。

　　3 讨论

　　不同来源的 Trypsin 基因片段在不同的宿主菌中已成功构建，其中在 Pichia Pastoris 中实现了猪源、牛源Trypsin 的可溶性表达，但是产量都并不高。其中在 E． coli 表达人源胰蛋白酶源-1，由于其富含二硫键，目前所获得产物主要以包涵体的形式出现，通过体外重折叠所获得的有活性的胰蛋白酶，得率相当低。但是 E． coli 由于发酵周期短、遗传背景清楚、成本低廉等优势，更被倾向优先作为宿主菌。本实验用所构载体 pET39b-tryp-sin-1 转化 BL21 ( DE3 ) 经 IPTG 诱导表达及发酵条件优化后，虽然没有实现预期的可溶性表达，但是在包涵体中实现了 DsbA-Trypsin 的大量表达。

　　所得沉淀超声破菌后经缓冲液的洗涤、变性、复性，用凝血酶切割，得到了有活性的胰蛋白酶，说明部分胰蛋白酶形成了正确的构象。以市售的猪胰蛋白酶为参照( 2. 5 g/L，250 U/mg) ，每 1 L 发酵液获得了约 1. 6 mg 有活性的 Trypsin，复性过程操作简便，适合放大过程。包涵体的复性与复性起始蛋白浓度、溶液的 pH 值、缓冲液的组分等条件有关，从图 3 中可以看出本实验在包涵体变性方面损失了大量的蛋白，在复性方面有待做进一步的探索。

　　本试验通过包涵体表达获得了大量的胰蛋白酶，由于胰蛋白酶有较多的二硫键，通过包涵体的洗涤、变性和复性，最后得到的有活性的蛋白得率较低。和包涵体蛋白复性相比，纯化可溶表达蛋白相对更节约成本和时间，利于放大生产，目的蛋白得率也较稳定和较高。本实验室利用载体 pET-39b( + ) 在 E． coli BL21( DE3) 中已成功表达了可溶性的牛肠激酶轻链 EKL片段，但是通过本试验证明同样的手段并不适用于人源胰蛋白酶的表达。本试验为后续在 E． coli 中探讨人源胰蛋白酶的可溶性表达可以提供一定的借鉴，如另有文献报道 Ds-bA 的突变型与真核蛋白 IGF-I，3C 蛋白酶，TGFβ-2和 GFP 等蛋白融合表达，有效的提高了目的蛋白的可溶性，值得尝试。此外，本试验表达的胰蛋白酶主要用于工业生产胰岛素原的激活反应，所以没有进行进一步的纯化试验，而直接用于胰岛素原的切割，这样可以减少多步纯化工序，节约成本。