LAMP技术的改进、发展及应用,生物化学论文

　　摘要：　环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是一种新式核酸扩增技术，它依靠一种具有链置换活性的DNA聚合酶与2对特殊设计的引物，在等温条件下即可高效快速地完成扩增反应。相较于传统扩增检测方法，LAMP技术具有特异性强、灵敏度高、操作简单快速等优点，更能在现场快速检测和基层应用中广泛推广，目前LAMP技术已广泛应用于植物病害检测、动物病害检测、食品安全检测等领域。基于此，简要介绍了LAMP技术的基本原理、反应产物的检测方法，重点阐述了LAMP技术的改进与发展，综述了近年来其在科研生产中的应用进展，并对其发展前景进行了展望，以期为LAMP技术的进一步发展提供合理的研究方向。

　　关键词：　环介导等温扩增技术; 核酸扩增; 生物技术; 检测; 植物病害; 应用;

　　Abstract：　Loop-mediated isothermal amplification(LAMP) is a new nucleic acid amplification technology, which relies on an active DNA polymerase with chain replacement activity and two pairs of specially designed primers to complete the amplification reaction efficiently and quickly under isothermal conditions. Compared with traditional amplification detection methods, LAMP technology has the advantages of strong specificity, high sensitivity, simple and rapid operation, and can be widely popularized in field rapid detection and grass-roots application. At present, LAMP technology has been widely used in the detection of plant diseases, animal diseases, food safety and other fields. Based on this, the basic principle of LAMP technology and the detection method of reaction products was briefly introduced, the improvement and development of LAMP technology was emphatically expounded, its application progress in scientific research and production in recent years was summarized, and its development prospect was looked forward, in order to provide a reasonable research direction for the further development of LAMP technology.

　　Keyword：　loop-mediated isothermal amplification; nucleic acid amplification; biological technique; detection; plant disease; application;

　　基因扩增是分子生物学领域的基本研究手段之一，传统的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)以及在此基础上发展起来的荧光定量PCR、免疫PCR等技术能够实现对生物体核酸的有效扩增与检测，但是由于存在所需仪器设备昂贵、反应时间过长等缺点，使得以PCR为基础的核酸扩增技术在现场快速检测和基层的应用推广中受到了一定的限制。

LAMP技术的改进、发展及应用

　　随着分子生物学技术的不断发展，新技术不断涌现。Notomi等[1]首次报道了环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)。该技术是一种新颖的核酸扩增技术，只需要在恒温(60～65 ℃)条件下反应30～60 min甚至更短时间即可完成核酸的扩增，无需使用昂贵的PCR仪[2]。LAMP技术能实现核酸扩增的核心之一就是使用2对特异性强的特殊引物：1对内引物和1对外引物。为了便于描述，将靶基因的目的序列进行命名(图1A),引物结构如图1B所示，外引物的碱基数量和浓度均需低于内引物，以保证内引物先于外引物和靶基因进行配对反应。LAMP技术的另一核心就是合成酶的选用。它使用的Bst DNA合成酶具有非常重要的链置换活性，使得LAMP扩增过程中发生链置换反应，即DNA聚合酶在延伸新链的过程中如果遇到了下游双链，可以继续延伸反应并同时将下游双链剥离而产生游离的单链。这两者是LAMP技术能够进行核酸扩增的重要基础[3]。

　　图1 LAMP扩增结构图[3]

　　A:靶基因序列命名；B:LAMP引物结构图

　　与传统PCR技术相比，LAMP技术具有诸多优点：特异性更强；灵敏度更高；操作简单、快速；结合反转录酶可直接完成对RNA的扩增检测；可与多种仪器结合，应用范围更广[4]。目前，我国已开发出多种商业化LAMP试剂盒，使检测成本进一步降低，促进了LAMP技术的推广和普及[5],为基层及落后地区相关机构进行现场快速检测提供了方便。凭借其简单、快速等优势，近年来LAMP技术在动植物病害、医疗、食品卫生、水生物与环境现场检测等方面得到了广泛的应用[5]。基于此，本文简要介绍了LAMP技术的基本原理、反应产物的检测方法，重点阐述了LAMP技术的改进与发展，综述了近年来其在科研生产中的应用进展，并对其发展前景进行了展望，以期为LAMP技术的进一步发展提供合理的研究方向。

　　1、 LAMP技术的原理

　　LAMP技术分为2个阶段，即起始物合成阶段(图2)和循环扩增阶段(图3)。起始物合成阶段最终形成一条茎环状DNA,作为循环扩增阶段的模板；循环扩增阶段在内引物和Bst DNA合成酶的引导下发生置换反应，形成长短不同的茎环结构，最终的扩增产物为茎环状DNA与花椰菜状DNA所组成的混合物[1]。扩增完成后需要对产物进行检测，目前检测LAMP产物的主要方法有：琼脂糖凝胶电泳检测，其结果为梯带状的多个条带[6];实时浊度法检测，扩增所产生的白色沉淀与DNA量之间呈线性关系，对扩增全过程实时监控，比琼脂糖凝胶电泳等终点检测法效率更高、结果更准确，但该方法适用于实验室而不适于现场检测；荧光比色检测，在反应体系中加入羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue, HNB),可以通过观察LAMP产物的颜色(阳性反应的产物为紫色，阴性反应则为天蓝色),直接判断靶基因是否成功扩增[7,8]。

　　图2 LAMP起始物合成阶段[1]

　　Fig.2 LAMP initiation synthesis phase[1]

　　图3 循环扩增阶段[1]

　　Fig.3 Loop amplification phase[1]

　　2、 LAMP技术的改进与发展

　　自2000年被推出以来，LAMP技术受到越来越广泛的关注，但检测对象的局限性、多对引物设计的困难性、反应程序优势不够明显、技术应用的单一性等问题都使得LAMP技术难以得到更好的推广应用。随着技术的发展，各领域的专家在利用LAMP方法的同时也对此技术不断进行研究改进，使得LAMP技术得到了很大的优化提高。

　　2.1、检测样品的拓展

　　最初被提出时，LAMP技术主要是针对DNA的检测。Notomi等[1]不仅对DNA进行了检测，也对RNA进行了尝试，发现LAMP技术配合反转录酶进行RT-LAMP,可以对RNA直接进行检测，随后也证实了RT-LAMP检测技术的可行性与准确性。目前，LAMP技术不仅可对DNA与RNA样品进行检测，而且对检测样品的纯度要求与普通PCR相比较低。2007年Kaneko等[9]研究发现，LAMP技术对各种培养基成分具有较好的耐受性，检测样品不需要纯化就能直接进行扩增，降低了对检测样品的要求，极大地缩减了检测成本，使LAMP技术得到了更广泛的应用。

　　2.2、引物设计的发展

　　虽然自开发以来LAMP技术得到了广泛的应用，但其引物设计是一大难点。一个反应需要设计至少4条引物，繁琐的引物设计过程需要研究人员花费大量时间进行分析。但随着科学技术的进步与发展，引物设计网站(如PrimerExplorer、BioSunLAMP等)建立了专业的LAMP引物设计模块，用户只需要像设计普通PCR引物那样提供相关参数，系统就可产生多套LAMP引物组合以供选择，极大地提高了引物设计效率，节省了实验时间。

　　2.3 、反应程序的优化

　　由于LAMP技术是恒温扩增反应，减少了PCR反应中控制温度变化所需的时间，所以在60 min左右的时间内就能完成整个反应，比PCR速度更快，但是相较于临床研究中常用的免疫学技术，所用时间仍然过长。因此，人们对其反应程序进行了改进与优化。研究人员通过加入2条环引物等方法，使反应时间缩短一半，最短可达11 min, 且灵敏度比PCR技术高出2个数量级，极大地提高了检测效率[4,10]。

　　2.4 、与其他技术的联用

　　随着技术的进步，研究人员将LAMP技术与其他技术进行联用，开发出许多优秀的检测方法。例如，将LMAP技术与聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合，发展出一种微孔LAMP反应，减少了模板和引物的用量并能检测1个DNA分子[10];将LAMP技术与核酸杂交结合，应用多重LAMP技术进行扩增，使反应操作更简便快速且灵敏度高、特异性强，适用于临床快速检测[11];免疫捕获技术与LAMP技术联用比与PCR技术结合的灵敏度高[12]。可见，LAMP技术与其他技术的联用使得LAMP技术得到了更好的发展，同时也开发出具有不同功能的LAMP检测试剂盒，使得LAMP技术应用更加广泛。

　　3 、LAMP技术的应用

　　自2000年推出以来，凭借操作简单、反应快速等优势，LAMP技术在植物病害检测、动物病害检测与食品安全检测等领域得到了广泛的应用。

　　3.1、在植物病害检测中的应用

　　近年来，LAMP技术不断发展，可为植物病害防控提供病情预警和病害诊断依据，得到了广泛应用。目前，该技术适用于真菌、细菌、病毒与线虫等植物病原物的检测[13]。

　　3.1.1 、真菌病害的检测

　　近年来，LAMP技术已广泛应用于植物病原真菌的快速检测。利用LAMP方法加入HNB等指示剂，能够快速有效地对曲霉(Aspergillus spp.)[14]、疫霉(Phytophthora spp.)[15]、腐霉(Pythium spp.)[16]、小麦白粉菌(Erysiphales)[17]等真菌完成现场检测，无需分离真菌与植物的DNA,且检测限可达到pg级甚至fg级，灵敏度远高于普通PCR方法。将LAMP方法与移动阅读器等电子设备结合，可形成一种实时监测致病疫霉的系统，及时有效控制其危害[18]。Chiara等[19]开发出一种检测悬铃木溃疡病菌(Ceratocystis fimbriata)和栎树猝死病菌(Phytophthora ramorum)等不同类型的检疫性病原物的便携式仪器，增设了1对环引物，最快可在15 min内完成检测，促进了植物检疫部门在入境口岸和现场的检疫工作开展。针对不同真菌病害的检测需求，LAMP技术相继得到优化，相关设备得到研发，有望在田间条件下使用，使病害预测更加准确和高效，有助于田间病害的及时防治。

　　3.1.2、细菌病害的检测

　　传统的分离培养法一直是细菌检测的金标准，但是该方法步骤繁琐、费时费力，使用更简便的检测方法，如LAMP技术，是实现细菌快速检测的必然需求[10]。针对病原菌设计特异引物，可特异性检测细菌性果斑病(Acidovorax avenae subsp. citrulli)、细菌性溃疡病(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis)、炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides)等，灵敏度比常规PCR高约1 000倍，大大提高了细菌病害的检测效率[20,21]。利用LAMP技术可直接通过细菌悬浮液检测丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv. tomato),无需菌株分离和复杂的DNA提取，非常适用于植物检疫和现场检测[22]。在LAMP方法中加入荧光染料，能够可视化快速诊断柑橘苗木黄龙病[23]与柑橘溃疡病[24],对柑橘的田间生产具有重要意义。可见，LAMP技术可以满足植物检疫和田间病害诊断需求，有利于控制细菌病害的传播扩散。

　　3.1.3 、病毒病的检测

　　LAMP技术现已用于DNA病毒和RNA病毒的快速检测。RNA病毒检测中常用的技术为RT-PCR,需要先用逆转录酶将RNA逆转录成DNA,然后以其为模板通过PCR扩增检测，耗费了大量时间，增加了成本，而LAMP技术在检测RNA病毒时加入逆转录酶，将逆转录步骤与扩增检测步骤同时进行，大大节省了时间成本，更便于RNA病毒的检测[25]。瓜类坏死斑病毒(Melonnecrotic spotvirus, MNSV)、小苍兰花叶病毒(Freesia mosaic virus, FreMV)、百合无症病毒(Lily symptom less virus, LSV)、百合斑驳病毒(Lily mottle virus, LMoV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)等严重危害植物的生长与观赏价值，运用RT-LAMP可特异性快速检测这些病毒，操作简单、检测效率高，非常适用于进口植物、田间样品的检测，且已研制出相应试剂盒，更利于在基层进行推广应用[26,27,28]。

　　3.1.4、线虫病害的检测

　　近年来，关于运用LAMP技术检测植物线虫病害的文献报道较少。根结线虫是分布最广、危害最重的植物寄生线虫，针对不同根结线虫的种类特异基因区段设计特异性LAMP引物，加入荧光染料可直接可视化检测植物或土壤中相关线虫的存在，无需“先分离线虫，再提取DNA”步骤，更简便且灵敏度更高[29,30]。

　　综上所述，选择合适的靶基因设计高特异性引物是LAMP能否成功的重要条件。LAMP技术已经广泛用于植物病害的检测，其灵敏度远高于普通PCR技术，且对于样品的纯度、用量要求更低，结合显色指示剂能够实现可视化检测，操作更加简单快速，可满足田间现场的检测要求，有利于对田间病害的早期快速诊断治理。LAMP技术有望成为植物病害诊断的常用方法，广泛用于农村基层和条件相对落后的地区。

　　3.2 、在人类疾病检测中的应用

　　由病原物侵染造成的动物病害，尤其是人类疾病，对人类生命安全和发展有着重大的影响。LAMP技术作为新兴的技术手段，具有快速特异的优点，已被广泛应用于临床疾病的检测，给患者提供及时有效的医疗方案[31]。

　　3.2.1、病毒检测

　　人类历史上曾出现过许多造成大规模影响的流行性病毒病，其中RNA病毒居多[32]。H7N9禽流感病毒、寨卡病毒(Zika virus)、登革热病毒(Dengue virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、日本乙脑病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)、诺如病毒(Norwalk virus, NV)、水痘带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)等都严重危害人类健康，在世界范围内造成过一定的影响，选择合适的靶基因结合反转录酶构建RT-LAMP技术，再结合荧光染料可实现对RNA病毒的特异性可视化检测，最短15 min内即可完成，且敏感度和特异性分别可达到96.8%及100%,利于医疗卫生场所现场快速诊断，可为疾病流行的预警与早期治疗提供有效保障[33,34,35,36,37]。这表明RT-LAMP是一种简便、快速、高灵敏和高特异的核酸扩增方法。

　　此外，病毒不仅危害着人类的健康安全，还对养殖动物造成危害，如牛白血病病毒(bovine leukaemia virus, BLV)、对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)等，直接影响经济效益，利用LAMP技术可分别对这些DNA病毒进行检测，最低检测限可达到2.25 copies·μL-1,灵敏度比普通PCR技术高出10倍，且与其他病毒、细菌等病原无交叉反应，特异性极好[38,39]。

　　3.2.2、细菌检测

　　大多数的人类呼吸道等常见疾病如结核病、细菌性肺炎等都是由细菌感染引起的，其控制的关键因素是通过监测预防传染以及快速诊断和有效治疗。LAMP技术已在临床中用于多数该类疾病的检测和诊断。

　　结核病是世界上最具传染性的呼吸道疾病之一，LAMP技术结合横向流动试纸条(lateral flow dipstick, LFD)能够实现可视化检测其病原菌，如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、肠出血性大肠杆菌(Escherichia coli),不存在交叉反应，特异性好，且检出限为1.3 CFU·mL-1,高出PCR方法2个数量级，对结核病的早期快速诊断和及时治疗具有积极作用[40,41]。LAMP技术对引起肺炎疾病的多种病原细菌也均能完成检测[42,43,44]。

　　3.2.3、寄生虫检测

　　以LAMP为基础的检测技术已广泛应用于原生动物寄生虫的检测，包括蠕虫(helminth)、锥虫(Trypanosoma spp.)、疟原虫(Plasmodium spp.)、巴贝虫(Babesia spp.)、血吸虫(Schistosome spp.)、隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)等寄生虫[45,46,47,48]。

　　总结用于蠕虫、吸虫等寄生虫检测的LAMP方法，并与PCR方法进行对比，发现LAMP技术检测寄生虫的灵敏度平均比PCR技术高约100倍，最高可相差10 000倍；而且LAMP技术检测成本低廉，更加快速简便[46,47]。利什曼原虫(Leishmania spp.)作为一种重要寄生虫，能引起多种不同症状的利什曼病，严重危害人类健康。利用LAMP方法可以检测不同症状的利什曼病，且已开发出相应的检测试剂盒，有利于发展中国家及落后地区及时诊断治疗利什曼病[47]。

　　可见，LAMP技术在人类疾病的诊断中具有众多优势，其检测效率和灵敏度高、操作简便、要求低、结果可视化、检测时间短，这为疾病监测和及时诊断治疗提供了必要的保障，使疾病能够得到更有效的控制。

　　3.3 、在食品安全检测中的应用

　　食品安全是当前社会关注的热点话题，而要保障食品安全需要快速精确的技术方法来检测食品中是否含有不利于人类健康的物质。相较于传统检测方法，LAMP技术拥有众多优点，使得其在食源性致病菌的检测和食品成分分析方面得到了广泛应用[49]。

　　3.3.1 、食源性致病菌的检测

　　利用LAMP技术可以检测食品中可疑的真菌、细菌等病原微生物，防止受污染的食品流入市场，保障食品安全。

　　食源性真菌的主要致病方式是产生真菌毒素，对人类食品或动物饲料供应链构成潜在风险，危害人畜健康。棒曲霉素是一种广泛存在于食品中的有毒的真菌次生代谢产物，基于棒曲霉素生物合成途径的异环氧脱氢酶基因设计LAMP引物，可以特异性检测出产生棒曲霉素的青霉菌种(Penicillium),检测限达到2.5 pg基因组DNA[50]。

　　目前，LAMP已经成功用于多种食源性致病细菌，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[51]、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)[52]、沙门氏菌(Salmonella spp.)[53]、志贺氏菌(Shigella castellani)[53]、大肠杆菌(Escherichia coli)[54]等的检测，检测灵敏度可达10 fg·μL-1,与基于同源加尾系统(homo-tag assisted non-dimer, HAND)的高分辨率熔解曲线技术(high-resolution melting curve technique, HRM)联用可同时检测多种致病细菌，实现了设备落后地区快速检测的要求，降低了食源性致病细菌产生中毒反应甚至致死的威胁。可见LAMP检测技术对于食品饮料行业的质量控制是一种有前途的快速诊断工具。

　　3.3.2 、食品成分分析

　　利用LAMP技术，可对食品的组成成分进行检测，以打击食品掺假等不法行为。

　　加工肉类中常含有的盐分、香料、食用油等，虽然会影响PCR的检测，但是不影响LAMP的检测[55]。将DNA的碱性裂解法和LAMP技术结合，能够检测出牛肉中含量0.1%的猪肉，并排除相关物种(如牛、羊、鸡)的交叉影响，可有效打击市场上的肉品掺假现象[56]。

　　利用荧光染料，能够可视化检测羊奶制品中掺入的牛源性奶成分，特异性极好，荧光效果明显，能检测出羊乳中掺假0.1%的牛乳，完全满足市场掺假量5%的检测需要，可作为乳品市场监督检验的可行方法[57]。

　　随着转基因技术的发展，转基因农产品和食品的应用越来越广泛。LAMP技术凭借其良好的特异性、操作简单快速等优点，在转基因生物(genetically modified organisms, GMOs)检测中得到了广泛应用。近年来已经开发了一系列可视化和实时LAMP检测方法，用于现场快速、经济、高效地检测GMOs, 无需耗时的电泳分析，可检测出高达0.005%～0.1%的转基因含量，灵敏度远高于PCR技术[58]。

　　综上所述，相较于其他检测方法，LAMP技术具有明显的灵敏度优势；和其他技术的联用，不仅能同时对多种不同的食源性致病菌进行检测，极大地降低了检测成本，还能进行食品成分分析，有效打击市场上的“掺假”乱象。可见LAMP技术在食品安全检测上的应用前景非常广阔。

　　4 、展望

　　作为分子生物学领域的研究手段之一，传统的PCR扩增技术由于存在所需仪器设备昂贵、反应时间过长等缺点，难以在现场快速检测和基层的应用中实现推广普及；而LAMP技术作为近年来新兴的扩增检测方法，拥有许多传统扩增方法难以达到的优势，更有希望在基层和现场检测中得到广泛利用。

　　但是LAMP的扩增产物为不同长度的茎环DNA和花椰菜状DNA的混合物，电泳呈阶梯形条带，明显无法达到克隆基因的目的[7]。尽管该方法无法作为克隆基因的手段，但作为检测方法，LAMP技术拥有众多传统方法难以达到的优势，使其成为近年来的研究热点。综合前人研究，本文认为，LAMP技术未来的研究发展重点在以下方面：针对LAMP技术的多对引物设计，可以进一步优化引物设计程序，使LAMP引物设计更加便捷精准，节约筛选时间；针对LAMP技术的极高灵敏度、开盖易造成污染，可以将LAMP产物的检测置于其他技术仪器中，使其闭管即能完成检测；目前LAMP技术已产生了许多试剂盒、检测仪器等，但为了得到更广泛的推广与利用，LAMP检测仪器应该向小型化、便携化发展，才能更好的服务于基层和现场检测工作。

　　总之，LAMP技术作为一种新型核酸扩增检测技术，在动植物病原物检测、食品卫生检测等领域的应用前景非常广阔，但也需要不断完善与发展，才能更好的服务于社会。

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