蛋白质晶体学是研究蛋白质结构与功能关系的重要方法． 近年来，同步辐射光源强度的提高和晶体结构解析方法的更新都获得了快速的发展，但是蛋白质的结晶仍然是晶体学中的瓶颈． 蛋白质的结 晶 包 括 最 初 的 结 晶 条 件 的 摸 索 ( de novocrystallization screening ) 和 结 晶 条 件 的 优 化( crystallization optimization) 两个步骤． 最初条件的摸索主要依靠高通量的筛选． 结晶条件的优化除了改变蛋白和沉淀剂浓度，加入添加剂等方法外，晶胞接种法在其中具有重要的作用． 晶胞接种法包括微晶胞接种法和大晶胞接种法． 微晶胞接种法主要用于得到单晶来改善衍射质量，而大晶胞接种法则主要用于得到大体积的单晶来提高衍射分辨率．由于第三代 X-光同步辐射的强度非常高，蛋白晶体X-光衍射所需体积一般而言在 10－ 6～ 10－ 4立方毫米就足够了，因此大晶胞接种法在 X-光衍射晶体结构学中的应用已经趋少． 但是，X-光衍射是对蛋白质中原子或离子的电子产生的衍射，它只能测出电子含量比较多的“重”原子或离子( 碳、氮、氧、磷、硫等) 的空间位置，而对只有极少电子的极性氢原子( H3O+，－ OH，H2O，－ NH － ，－ NH2，－ NH3等基团中的氢原子或离子) 则无法检测出，即使是在高于1. 0 分辨率的 X-光衍射晶体结构中也是如此．蛋白晶体的中子衍射是对原子或离子的原子核产生的衍射． 氘原子(2H) 作为氢原子(1H) 的同位素，对中子衍射非常敏感． 将蛋白质中的氢氘置换后，氘的空间位置在 2. 0 的分辨率就可以清晰地被中子衍射检测到，这样我们可以很准确地推断出原先蛋白质中氢的位置． 得到蛋白质中氢原子的空间位置对研究蛋白催化反应的机理、蛋白的热动力学和蛋白-药物相互作用的分析都具有重要的意义． 然而，由于技术原因，中子辐射的强度只有X-光辐射强度的百万分之一，因此在大多数情况下只有 1 立方毫米以上体积的巨大晶体才有足够的分辨率观察到蛋白质中的氢原子或质子． 截至到2013年 8 月 30 日，在国际蛋白结构数据库中，蛋白晶体的 X-光衍射结构有 674 789 个，而中子衍射结构只有区区43 个，只占晶体结构总数的 0. 06% ． 造成这种结果的主要原因除了晶体的中子衍射所需时间长( 10 d以上) 以外，得到 1 立方毫米以上体积的巨大晶体相当困难是另一个主要原因． 因此，如何进一步发展大晶胞接种法，获得巨大体积的蛋白晶体就显得非常重要．本文以非聚合性肌动蛋白( AP-actin)和里氏木聚糖酶为研究对象，详细探讨了微晶胞接种法和大晶胞接种法在结晶时的应用． 非聚合性肌动蛋白的 X-光衍射晶体结构虽然已经发表，但是通过连续多步微晶胞接种的方法得到高分辨率的单晶在相关文献中没有报道． 里氏木聚糖酶虽然已经被研究多年，在蛋白晶体结构数据库中有 293 个 X-光衍射晶体结构，但是中子衍射晶体结构则一个也没有． 本文讨论了如何通过大晶胞接种的方法得到体积到达 2 立方毫米的里氏木聚糖酶晶体，其中子衍射分辨率达到 2. 0 ，从而为它的中子衍射晶体结构的研究打下坚实的基础．
1 材料与方法
1. 1 材料
木聚糖酶突变体( N44D 和 E177Q) 的基因构建购自美国 DNA2. 0 公司( 里氏木聚糖酶基因采用编码子优化合成后，克隆到 pJexpress401 表达载体上) ．非聚合性肌动蛋白( AP-actin) 由美国佛蒙特大学Kathleen Trybus 实验室提供． 蛋白胨( trypton) 和酵母提取物( yeast extract) 购自美国 Invitrogen 公司．HiTrap SP-Sepharose 强阳离子交换柱和 HiLoad 16 /60 Superdex75 pg 分子筛柱购自美国 GE 公司． 结晶试剂盒 Crystal ScreenTM、IndexTM、PEG·IonTM、PEGＲx购自美国 Hampton Ｒesearch 公司． 其它化学试剂购自美国 Sigma 公司． 大肠杆菌 BL21-gold 细胞株由本实验室保存．
1. 2 木聚糖酶的表达与纯化
100 μL 感受态细胞在冰上溶解后，加入 1 ～ 3μg 的质粒． 静置 10 min 后，放入42 ℃水浴 45 s． 在冰上冷却 5 min 后，加入 900 μL 无菌的溶源性肉汤( lysogeny broth，LB) ，放入37 ℃培养1 h． 6 000 g 离心后，去掉 900 μL 上清液． 剩下 100 μL 培养液同细胞混匀后铺到含卡拉霉素的琼脂糖平板上，37 ℃培养过夜． 挑出长出的单菌落进行细胞培养和蛋白表达．转化细胞接种到 50 mL 的 LB ( Luria-Bertani)培养液 37 ℃培养过夜． 取 10 mL LB 培养液到 1 LEnfor’s 基本培养基中，37 ℃ 培养到 A600吸收值在 0. 4 ～0. 8 之间后，降温到18 ℃，加入 0. 5 mmol/LIPTG 诱导蛋白表达． 6 000 g 离心去除培养液后，细胞用 50 mmol/L MES 缓冲液( pH6. 0) 悬浮． 细胞用超声破碎后，15 000 × g 离心去除细胞碎片． 上清液过 20 mL HiTrap SP-Sepharose 填充柱进行第一次蛋白纯化． 用 0 ～1 mol/L 氯化钠浓度梯度洗脱后，纯化的蛋白用 Centricon( Millipore 公司产品) 离心浓缩到小于 2 mL 体积． 浓缩液过 12 mL HiLoad 16/60Superdex 75 pg 分子筛柱在 0. 1 mol / L Tris 缓冲液( pH8. 5) 进行第二步蛋白纯化． 洗脱液的纯度经SDS-PAGE 检测后，浓缩到 30 ～ 50 mg / mL 在-80 ℃保存．
1. 3 木聚糖酶突变体 E177Q 的结晶和微晶胞接种
木聚 糖 酶 突 变 体 E177Q 和 底 物 木 聚 六 糖( xylohexaose) 形成的复合物( E177Q-X6) 的结晶条件用悬滴法来进行摸索: 1 μL 复合物溶液( 30 mg/mL E177Q，0. 1 mol / L NaCl，0. 1 mol / L Tris，pH8. 5，50 mmol / L Xylohexaose) 与 1 μL 池液( 具体成分视结晶条件试剂盒的成分而不同) 混合后，与 0. 5 mL池液在封闭的环境下平衡．将最初得到的 E177Q-X6 晶体聚合物( Fig． 1A)从结晶溶液中转移到沉淀剂浓度升高了 2% ～ 5%的稳定液中( stabilization solution) ，然后用灼烧过的毛细玻璃管压碎，再将体式显微镜也无法见到的微晶体溶液用稳定液梯度稀释 10 倍、100 倍、1 000 倍和 10 000 倍． 从上述 100 倍、1 000 倍和 10 000 倍的稀释液中分别吸取 0. 4 μL 小晶体溶液，加入到预平衡好的蛋白结晶溶液中( 结晶沉淀剂浓度比最初结晶溶液的沉淀剂浓度降低 2% ～5%) ．
1. 4 木聚糖酶突变体 N44D 的结晶和大晶胞接种
木聚糖酶突变体 N44D 的无配体蛋白溶液( 30mg/ mL N44D，0. 1 mol / L NaCl， 0. 1mol / L Tris( pH8. 5) ) 的最初结晶条件采用悬滴法用不同试剂盒来筛选( 同上) ．将得到的 N44D 单晶从结晶溶液中转移到降低了沉淀剂浓度( 2% ～ 5%) 的池液中，多次清洗后，再将这个单晶转移到预平衡好的大体积( 100 μL)蛋白结晶溶液中( 结晶沉淀剂的浓度同样比最初降低 2% ～ 5%) ． 由于悬滴法不能用大体积蛋白溶液，本文采用美国 Hampton Ｒesearch 公司生产的可以承 载 大 体 积 的 9 孔 玻 璃 盘 在 三 明 治 盒 子( Sandwich Box) 中以坐滴的方式来得到大体积单晶．
1. 5 肌动蛋白的结晶和多次微晶胞接种
非聚合性肌动蛋白同 ATP 复合物( 10 mg/mLactin，5 mmol / L Tris-HCl， pH 8. 2，0. 2 mmol / LCaCl2，0. 1 mmol/L sodium azide，0. 5 mmol/L DTT，0. 2 mmol / L ATP) 结晶条件用悬滴法来筛选 ( 同上) ． 肌动蛋白的微晶胞接种过程与木聚糖酶E177Q-X6 过程相同，但是重复多次．
1. 6 晶体衍射数据的收集和处理
晶体的 X-光衍射数据收集过程如下: 将木聚糖酶晶体从结晶溶液捞出后，在含 20% 甘油的稳定液中浸泡一下后捞出，在液氮中快速冷冻． 20% 甘油作为冷冻保护剂( cryoprotectant) 使得冷冻的晶体周围不会有冰晶形成． 肌动蛋白晶体溶液中含有25%2-methyl-2，4-pentanediol( MPD) ，本身可以作为冷冻保护剂，可以将晶体直接在液氮中冷冻． 晶体衍射数据由 Ｒigaku ＲUH3Ｒ 发生器和 Mar345 成像板构成的 X-光衍射仪收集，并用 HKL2000软件处理．晶体的中子衍射数据收集过程如下: 将木聚糖酶突变体 N44D 的大体积晶体( 2 ～ 3 立方毫米) 放入石英玻璃管中，然后在玻璃管的末端加入用重水( deuterium oxide) 配制的稳定液． 在 18 摄氏度放置4 周后，晶体中 80% 可置换氢已经被氘取代． 晶体的中子衍射数据在美国 Los Alamos 国家实验室的蛋白晶体站( Protein Crystallography Station，PCS)收集后，用劳厄中子衍射( Laue Neutron Diffraction)程序处理．
2 结果
2. 1 微晶胞接种可以极大地改善晶体衍射质量
用结晶条件试剂盒筛选木聚糖酶突变体 E177Q与底物木聚六糖形成的复合物 E177Q-X6 的悬滴法结晶条件如下: 1 μL 的池液( 0. 2 mol/L ammoniumcitrate tribasic( pH 7. 0 ) ，20% PEG 3350 ) 加 1 μLE177Q-X6 复合物溶液( 30 mg / mL E177Q，0. 1mol / LNaCl， 0. 1 mol / L Tris， pH8. 5， 50 mmol / LXylohexaose) ，与 0. 5 mL 池液平衡 2 d 后晶体形成，5 d 后晶体长到最大． 由于最初获得的 E177Q-X6复合物晶体长在一起无法分离成单晶，我们从原来的多晶中切下一小块长得最好的部分，压碎，得到非常小的细微晶体，再用微晶胞接种的方法得到单晶． 单晶的 X-光衍射分辨率可以达到1. 1 ．肌动蛋白的悬滴法结晶条件如下: 1 μL 蛋白溶液与 1 μL 池液 ( 20 mmol/L CaCl2，100 mmol/LNaAc，25% MPD，pH4. 8) 混合后，与 0. 5 mL 池液混合，在 4℃平衡． 1 天后晶体出现，5 天后晶体长到最大． 得到的多个细小晶体长在一起，无法分开． 第一次微晶胞接种后，得到的晶体虽然有所改善，但是仍然是衍射质量很差的多晶体混合物． 继续用微晶胞接种的方法改进晶体质量，在第四轮接种后，终于得到 10 μm × 10 μm × 100 μm 单晶． 这个单晶的 X-光衍射分辨率达到 1. 9 ．
2. 2 大晶胞接种法可以得到大体积单晶
木聚糖酶突变体 N44D 的结晶条件如下: 1 μLN44D 溶液与 1 μL 池液( 15% PEG8000，0. 2 mol / LNaI，0. 1 mol / L MES 缓冲液，pH6. 0) 混合后，与 0. 5mL 池液平衡． 2 d 后晶体出现，5 d 后晶体可以长到0. 1 mm × 0. 2 mm × 0. 2 mm． 这样体积的晶体对中子衍射远远不够，必须进行大晶胞接种． 在大晶胞接种的过程中，这个从原先结晶溶液中捞出的小单晶必须先在池液中清洗几次以去除可能在晶体表面附着的其它微小晶体． 否则，多个晶体会长在一起形成多晶体． 由于池液中的沉淀剂浓度比结晶溶液中的沉淀剂浓度低，作为晶核的小晶体会有一定程度的溶解． 这样，小晶体表面锋利的边缘会消失，晶体体积减小，甚至在晶体表面出现裂缝． 这个小晶体加入到预平衡的 100 μL 结晶溶液后，蛋白分子不断地从溶液中析出并附着到小晶体表面上，使得小晶体不断长大，20 d 以后达到 2 mm3( 0. 8 mm × 0. 9 mm × 3 mm) ． 在转移晶体的过程中不能摩擦晶体表面，避免极细微的晶胞被刮下，造成多个晶核被引入结晶溶液中． 大晶胞接种的过程中，最好只有 1 个晶体在溶液中生长，这样可以有尽可能多的蛋白附着于其上，使其体积长到最大． 这个大晶体的中子衍射分辨率为 2. 0 ．
3 讨论
得到衍射质量高的晶体是蛋白质晶体结构研究的难点． 虽然结晶点样机器人能大规模地利用结晶试剂盒筛选最佳的初始条件，但是在很多情况下得到的初始晶体不是单晶，晶体的衍射图谱不能被用于解 析 结 构． 根 据 结 晶 相 图 ( crystallizationdiagram)，晶体成核区( nucleation zone) 往往有大量的小晶体形成． 如果晶体形成的速度过快，它们会长在一起形成多晶体． 在相图的亚稳定区，没有新的晶体形成，已经形成的晶体会继续长大直到蛋白溶解曲线的边缘． 微晶胞接种法其实就是利用成核区和亚稳定区的分别将微小晶体直接引入亚稳定区来得到高质量的晶体． 这些在体式显微镜中也看不到的细微晶体是从原来的晶体上“刮”下来的，它们的晶型往往比原来的母晶要好，所以以它们为种子长出的晶体的质量会有很大地改善． 当一次微晶胞接种不能获得高质量的单晶时，重复多次微晶胞接种可以最终得到满意的效果． 在微晶胞接种的过程中，稳定液中沉淀剂浓度一般要比原来结晶溶液的沉淀剂浓度要高． 这样可以有效地避免微晶胞被溶解而不能被引入新的结晶溶液的情况发生． 经过预平衡的新结晶溶液的沉淀剂浓度比最初结晶溶液要低，这样可以使晶体的生长处于亚稳定区而没有新的晶体形成．连续多次微晶胞接种法可以极大地改善蛋白晶体的衍射质量． 本文以肌动蛋白为例，详细介绍了这种方法的应用和重要作用，从而丰富了微晶胞接种法的内容．本文采用每 10 倍梯级稀释的方法来获得微晶胞原液，这样可以控制原液中的微晶胞数目，不至于将过多的晶胞引入结晶溶液中而只能得到过小体积晶体． 根据我们的经验，100 倍和 1 000 倍的稀释度最为适合． 但是不同的蛋白晶体的稀释度还是要通过实验来确定． 微晶胞原液最好新鲜配制．在大晶胞接种的过程中，单个大晶胞从最初的结晶溶液中取出后，要在稳定液中快速清洗几遍，才能加入到新的预平衡好的结晶溶液中． 这个稳定液中沉淀剂浓度一般比原先要低，这样可以溶解晶体表面可能存在的其它小晶胞． 由于这个被转移的晶体比较大，清洗的过程不会将整个晶体都溶解． 在清洗的过程中晶体可能会出现裂缝等现象，但是在新的结晶溶液中长大后，晶核只占整个大晶体中很小一部分，不会影响到晶体的衍射质量． 稳定液中沉淀剂浓度的差别是微晶胞接种法和大晶胞接种法之间最显着的差别． 新的结晶溶液的体积至少是 30 μL，这样可以有足够多的蛋白连续附着到晶核的表面供其生长． 单个晶胞在转移的过程中，必须特别小心，不能有细微的小晶体从表面上被刮下来，从而造成多个晶体都去争夺溶液中的蛋白供其生长． 这样只有一个晶体在结晶溶液中生长，其体积可以达到最大． 以往的大晶胞接种法得到的晶体体积不到 1 mm3的主要原因就在于结晶溶液中有多个晶核存在，不能集中所有蛋白到一个晶体的生长．应用大晶胞接种法来获得体积为 1 mm3以上的巨大晶体非常有效． 本文以木聚糖酶为例，详细讨论了大晶胞接种法操作的细节和应该注意的问题． 它对以大体积晶体为基础的中子衍射结构学的发展，具有重要的意义．
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