功能化离子液体修饰猪胰脂肪酶的研究

　　脂肪酶( lipase，EC 3. 1. 1. 3) 主要是指一类能够催化甘油三酯水解生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯的酶，广泛应用于水解或醇解、酯合成、酯交换、内酯合成、多肽合成、高聚物合成及立体异构体拆分等有机合成反应，是目前用途最广泛的酶催化剂之一。猪胰脂肪酶( porcine pancreas lipase，PPL) 是一类重要的脂肪酶，在食品、化妆品、医药、洗涤剂和畜牧业等领域中均有广泛应用。然而，PPL 的应用仍然存在一些不足，如一般具有实际应用价值的目标化合物并不是它的天然底物; PPL 活力不高，在有机溶剂、高温、极端 pH 等非天然环境下极易失活等，这些不利因素限制了 PPL 在工业上进一步的广泛应用。因此，对 PPL 进行分子改性以强化其催化性能，为工业应用提供活性更高、稳定性更好、环境耐受性更强的新酶品种，具有重要的实际应用价值。

　　化学修饰具有廉价、周期短、实验室可行、容易创造新型的酶学性质等优点，是对脂肪酶进行分子改性的一种重要手段。虽然化学修饰 PPL 已经取得了一定的研究进展，但仍然局限于脂肪酸、氨基酸、酸酐、聚乙二醇( PEG) 和多糖等常用修饰剂的研究，修饰酶的催化活性、稳定性、耐有机溶剂性等性能往往不能同时得到有效的改善以满足反应的需要。

　　离子液体近年来在生物催化领域的应用越来越广泛，脂肪酶、蛋白酶、糖苷酶、醇氰酶、氧化还原酶等多种酶都在离子液体中显示出了很好的稳定性。在离子液体中酶催化的区域、对映体选择性往往都有所增加，尤其作为高极性底物的酶催化反应介质，离子液体显示出了巨大的潜力。笔者所在课题组将功能化离子液体作为酶固定化载体材料 SBA-15 的表面修饰剂，结果表明修饰载体固定化的酶对温度、pH 等的稳定性得到了有效提升，而且相对活力较游离酶有了较大提高。在固定化方法中，离子液体作为载体修饰剂。近几年，Bekhonche 等首次提出了离子液体修饰酶的新型化学修饰方法，用含羟基的咪唑、吡咯等离子液体修饰甲酸脱氢酶，修饰酶的活性和稳定性得到了显着提升。这些研究说明离子液体不仅可以作为反应介质用于酶催化反应中，还可以分别用作固定化载体及酶分子自身的修饰剂，目前还没有其他用功能化离子液体修饰脂肪酶的报道。本文以 PPL为例，希望发展一种酶分子改造的新方法。

　　1 材料与方法

　　1. 1 药品与试剂
　　PPL 购自 Sigma 公司并在 0 ～ 4 ℃ 下保存，酶的蛋白质含量为 9. 3%，以三乙酸甘油酯为底物时比酶活力为 362 U/g( 45 ℃、pH 7. 5) 。3 种离子液体氯化 1-羧甲基-3-甲基咪唑( 99%) 、氯化 1-羧甲基-3-乙基咪 唑 ( 99% ) 、氯 化 1-羧 甲 基-3-丁 基 咪 唑( 99%) 购自上海成捷化学有限公司。1-乙基-( 3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺( 98%) 、N-羟基琥珀酰亚胺( 98%) 、吗啉乙磺酸( 97%) 购自阿拉丁试剂公司。其余试剂购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

　　1. 2 离子液体的活化
　　取 0. 001 mol 的离子液体，加入 0. 001 2 mol 1-乙基-( 3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺及 0. 111 5 molN-羟基琥珀酰亚胺，在 5 mL 的吗啉乙磺酸溶液中，室温搅拌反应 2 h 后停止。

　　1. 3 活化的离子液体修饰 PPL
　　取 2 g PPL 用去离子水溶解，向酶溶液中缓慢加入活化的离子液体，在 0 ～ 4 ℃ 下，磁力搅拌 6 h后，在去离子水中透析 24 h 备用。修饰度的测量通过三硝基苯磺酸法才测定。

　　1. 4 蛋白质含量测定
　　按照 Bradford的方法，以牛血清蛋白作为标准蛋白质绘制标准曲线。测定酶液的吸光值，根据标准曲线计算蛋白浓度。

　　1. 5 酶活的测定
　　1) 三乙酸甘油酯乳化液的制备 将 6. 83 g 三乙酸甘油酯在强力搅动下缓慢加入磷酸缓冲液( pH7. 0) ，得到三乙酸甘油酯乳化液，再加入磷酸盐缓冲液定容至 100 mL。

　　2) 酶活测定 取 10 mL 上述制备的三乙酸甘油酯乳化液于100 mL 锥形瓶中，再加入15 mL 磷酸盐缓冲液( pH 7. 5) ，于 50 ℃、150 r/min 下预热 5min，然后向其中加入酶开始反应。反应 10 min 后取出，立即加入 15 mL 乙醇终止反应。用 0. 025mol / L 的 NaOH 溶液滴定，记录 NaOH 的消耗量。

　　在一定条件下，每分钟酶催化三乙酸甘油酯生成 1μmol 乙酸所需要的酶量，定义为一个酶活单位( U) 。

　　1. 6 最适温度及最适 pH 的检测
　　1) 最适温度 调节反应缓冲液 pH 为 7. 0，分别在 30、35、40、45、50、55、60 和 65 ℃ 下水浴反应 10min，取出测定酶活。

　　2) 最适 pH 调节反应液的 pH 分别为 6. 0、6. 5、7. 0、7. 5 和 8. 0，50 ℃ 下水浴反应 10 min，取出测定酶活。

　　1. 7 酶的热稳定性
　　将酶置于 50 ℃ 水浴中保温，分别在 0、0. 5、1、2、4、6 和 8 h 取出，冷却至室温，再测定酶活。酶活测定方法同 1. 5。设保温 0 h 时的游离酶的初始酶活为 100%。

　　1. 8 有机溶剂耐受性
　　在酶活测定的反应体系中，加入不同浓度的有机溶剂，测定修饰前后 PPL 在有机溶剂中的催化稳定性，设不含有机溶剂体系游离酶的初始酶活为 100%。

　　1. 9 紫外光谱测定
　　室温下，取相同浓度的 PPL、PPL-M、PPL-E 和PPL-B 在紫外可见分光光度计上分别测定其紫外可见吸收光谱，测定范围为 240 ～340 nm。

　　2 结果与讨论

　　2. 1 水解活力的考察
　　表 1 为经修饰后的酶与 PPL 的表观比酶活力的数据。【表1】

　　
　　由表 1 可知: 猪胰脂肪酶在经过修饰之后，活力有明显的提高，说明离子液体修饰脂肪酶的方法有利于水解活力的提高。其中离子液体修饰的酶，随着修饰度的增加活力增大，含短链的修饰有更好的水解活力，是游离酶的 1. 74 倍，而邻苯二甲酸酐对PPL 的修饰只提高了 25% 的水解活力。随着修饰剂的链长的增大，活力呈降低的趋势。

　　2. 2 最适温度的考察
　　根据经典酸碱滴定的方法，在不同温度下考察酶水解三乙酸甘油酯特性，结果见图 1。由图 1 可知: 原酶最适反应温度为 45 ℃左右; 经离子液体修饰后，PPL 的最适温度向高温方向移动至 55 ℃。与PPL 相比，修饰后的 PPL 对温度的适应范围更广。【图1】

　　经过修饰后的酶对在高温区相对游离酶更加趋于平缓，该点证明酶的离子液体修饰有助于提高温度的耐受性。
　　
　　2. 3 最适 pH 的考察
　　在不同 pH 条件下考察猪胰脂肪酶的三乙酸甘油酯水解特性，结果如图 2 所示。由图 2 可知: 修饰酶及游离酶的最适反应 pH 均为7. 5，修饰的 PPL 在6. 0 ～ 8. 0 之间对 pH 的敏感度明显降低，离子液体的修饰拓宽了酶的使用范围。【图2】

　　
　　2. 4 热稳定性的考察
　　热稳定性是酶催化工业化应用的一个重要因素。图 3 为酶的热稳定性实验结果。由图 3 可知:

　　游离酶的热稳定性较差，酶活下降快。在保温 2 h后，酶活仅为初始酶活的 20%。PPL-M、PPL-E 及PPL-B 的热稳定性均显着提高; 在保温 8 h 后，残余酶活仍然保持在游离酶初始酶活的 60% 以上，尤其是长链的离子液体修饰的酶，酶活降低的更缓慢，热稳定性更好。【图3】

　　2. 5 有机溶剂对酶活的影响
　　2. 5. 1 甲醇对酶活的影响
　　在 pH 7. 5、30 ℃不同甲醇体积分数的条件下，测定 PPL、PPL-M、PPL-E 及 PPL-B 的活力变化，结果见图 4。

　　由图 4 可知: 反应体系中加入不同体积分数的甲醇时，游离酶的相对活力一直在降低。而 3 种修饰酶的活力则是先升高，在高浓度的含甲醇体系中会下降，这可能是修饰后的酶在低浓度的甲醇中仍能维持构象稳定，而高浓度的甲醇会破坏部分氢键从而造成酶的解折叠。3 种酶的变化趋势比较一致，且普遍高于 PPL，3 种修饰酶的活力大小顺序( 从大到小) 为 PPL-M、PPL-E、PPL-B，但 PPL-B 的活力在含低浓度的甲醇中增加幅度高于其他 2 种修饰酶，在含高浓度的甲醇中的活力降低程度要低于其余 2 种修饰酶。【图4】

　　2. 5. 2 N，N-二甲基甲酰胺( DMF) 对酶活的影响
　　在 pH7. 5、30 ℃不同 DMF 体积分数的条件下，测定 PPL、PPL-M、PPL-E 及 PPL-B 的活力变化，结果见图 5。

　　由图 5 可知: 在反应体系中加入不同体积分数的 DMF 时，游离酶的活力一直在降低，而修饰酶均保持了较高的活力，在反应体系中存在 80%的 DMF 时，3 种修饰酶的活力仍然保持游离酶100 % 的相对活力以上。3 种修饰酶在不同浓度的 DMF 的反应体系中，酶活变化趋势一致，修饰酶的 水 解 活 性 均 高 于 原 酶 PPL。在 含 低 浓 度DMF 中，PPL-M 的酶活高于其他 2 种修饰酶，在DMF 浓度不断增加中，PPL-B 的活力受影响程度最弱，在 70% 以上的 DMF 体积分数中活力下降比例低于其他 2 种修饰酶，PPL 修饰后的耐 DMF的性能明显提高。【图5】

　　2. 6 紫外光谱表征
　　图 6 为脂肪酶 PPL、PPL-M、PPL-E 及 PPL-B 的紫外光谱变化图。由图 6 可知: PPL 经离子液体修饰后，紫外吸收光谱峰型未发生明显变化，说明修饰后对 PPL 的空间结构没有造成明显的影响，但原270 nm 处的吸收峰发生轻微红移，PPL-M、PPL-E 及PPL-B的最大吸收波长值分别为 271、272 及 275 nm，修饰酶的紫外吸光值均有所提高。【图6】

　　3 结 论

　　以 3 种阴离子的咪唑类离子液体对 PPL 进行化学修饰，修饰后的 PPL 水解活力明显提升，修饰度越高，水解活力越高，且随着修饰剂的链长的增大，活力呈降低的趋势。与原酶相比，修饰酶的热稳定、有机溶剂中的催化性能等酶学性质都得到了提高。
　　
　　参考文献:

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