脱氧核酶活性的抑制与恢复方法

　　端粒酶（ Telomerase） 作为一种核糖核蛋白，其主要功能是催化端粒（ Telomere） 末端不断延伸（ TTAGGG）n序列，从而克服细胞分裂过程中的端粒缩短问题，维持端粒的适当长度与稳定性。 尽管端粒酶在抗衰老研究中具有良好的前景，但它也是导致肿瘤细胞无限分裂的重要因素。 研究表明，端粒酶在 85%以上的人类肿瘤细胞中被高表达，而在正常体细胞中的表达量则极低甚至不表达[1]. 因此，端粒酶也被认为是最具通用性的癌症诊断与治疗的标志物之一，受到日益广泛的关注。

　　近年来，基于光谱、电化学以及纳米技术的各种端粒酶检测新方法不断涌现[2,3]. 但迄今最常用的仍是基于聚合酶链式反应（ PCR） 的端粒重复序列扩增（ Telomeric repeat amplification protocol,TRAP） 方法[4]. 这主要是因为端粒酶的含量非常低，即使在肿瘤细胞中也只有 50 个分子左右[5],因此提高检测的灵敏度始终是该研究领域必须面对的挑战之一。 尽管 TRAP 方法十分有效，可以检测低至几个细胞甚至单个细胞内的端粒酶，但其操作过程比较复杂、费时，而且容易产生假阳性信号。 其它一些非 PCR方法，例如电致化学发光[6]、表面等离子体共振（ SPR）[7]、石英晶体微天平（ QCM）[8]、生物条码（ BioBarcode）[9]和指数等温扩增端粒重复序列（ EXPIATR）[10,11]等，虽然也取得了较高的灵敏度，但同样具有体系复杂、操作繁琐及依赖精密仪器等局限。 因此，亟需发展一种更加简单、灵敏的端粒酶检测新方法。

　　脱氧核酶（ DNAzyme） 是通过体外分子系统进化技术（ SELEX） 筛选得到的一种具有催化功能的单链 DNA 片段[12~14]. 由于具有催化活性高、特异性好、稳定性强、容易合成以及信号转换机制灵活等优点，使其在生物传感领域获得了广泛的应用。 2004 年，Willner 等[15]首次应用具有过氧化物酶活性的脱氧核酶实现了端粒酶检测。 但该方法涉及多步表面修饰，操作复杂，而且容易受到细胞内端粒序列的干扰。 考虑到端粒 DNA 与脱氧核酶（ TGGGTAGGGCGGGTTGGGA） 的序列均固定不变，通过设计巧妙的探针来实现简便的端粒酶检测仍是一项十分艰巨的挑战[16]. 本文研究了脱氧核酶活性的抑制与恢复方法，通过优化发卡结构设计，并结合支点介导链置换技术（ Toehold-mediated Strand Displacement）[17],建立了一种简单、无标记的端粒酶检测新方法。
　　
　　1 实验部分
　　
　　1.1 试剂与仪器
　　
　　DNA 序列（ 见表 1） 均由生工生物工程（ 上海） 股份有限公司合成，采用高效液相色谱纯化； 2,2'-联氨-双（ 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸） 二胺盐（ ABTS2-,纯度 98%） 、氯高铁血红素（ Hemin,纯度≥98%） 、乙二醇双（ 2-氨基乙基醚） 四乙酸（ EGTA,纯度 97%） 、苯甲基-磺酰F（ PMSF,纯度 98. 5%） 和 3-[3-（ 胆酰胺丙基） 二甲氨基]-1-丙磺酸内盐（ CHAPS,纯度 98%） 均购自 Sigma-Aldrich 公司； 过氧化氢（ 质量分数≥30%） 和 Tris-HCl 缓冲溶液（ pH=7. 5） 购自 Fisher 公司； 实验用水为过滤除菌的超纯水。
　　
　　1.2 实验过程
　　
　　1.2.1 细胞培养 将 Hela 细胞置于 37 ℃ 二氧化碳恒温箱中[95%（ 体积分数） 空气，5%CO2]培养，培养基为 RPMI 1640,含 10%（ 质量分数） 胎牛血清蛋白（ FBS） 及 100 IU/L 青霉素。 细胞数量于每次实验前采用细胞计数板测定。

　　1.2.2 端粒酶的提取 采用通用的 CHAPS 方法提取端粒酶[18]. 首先采集处于指数生长期的 Hela 细胞，取 106个细胞置于 500 μL 离心管中，用 PBS 缓冲溶液洗涤 2 次； 加入 200 μL CHAPS 裂解溶液[0. 5%（ 质量分数） CHAPS + 10 mmol/L Tris-HC1（ pH = 7. 5） + 1 mmol/L MgC12+ 1 mmol / L EGTA +5 mmol / L 2-mercaptoethanol+0. 1 mmol / L PMSF+10%（ 质量分数） glycerol],并用移液器吹打直至细胞均匀分散； 将该溶液置于冰浴中孵育 30 min,再于 4 ℃下以 16000 r/min 转速离心 20 min,然后小心收集上层清液（ 不超过 160 μL） ,并分装于多个 50 μL 离心管中，于-80 ℃下冻存待用。

　　1.2.3 脱氧核酶探针的优化 将探针 TM-x（ 100 nmol / L） 与 Hemin（ 300 nmol / L） 在 HEPES 缓冲溶液[25 mmol/L HEPES（ pH=7. 8） +30 mmol/L KCl+200 mmol/L NaCl]中于室温下孵育 10 min,加入端粒酶引物 TS（ 200 nmol/L） 或者人工合成的端粒酶延伸产物 TS-R2（ 100 或200 nmol/L） ,继续孵育10 min;孵育结束后加入 ABTS2-（ 5 mmol/L） ,3 min 后加入过氧化氢（ 5 mmol/L） ,并开始记录415 nm 处的吸收信号。

　　1.2.4 端粒酶的检测 首先在 48 μL Tris-HCl 缓冲溶液[20 mmol / L Tris-HC1（ pH = 8. 3） + 1 mmol / LMgC12+1 mmol / L EGTA + 50 mmol / L KCl + 0. 05% （ 质量分 数 ） Tween 20]中加入端粒酶引物 TS（ 0. 8 μmol/L） ,再加入 2 μL 细胞提取液，混匀后在 30 ℃下孵育 2 h; 然后加入脱氧核酶探针 TM3-1（ 100 nmol/L） 、Hemin（ 300 nmol/L） 及 HEPES 缓冲溶液[25 mmol/L HEPES（ pH = 7. 8） +30 mmol/LKCl+200 mmol / L NaCl],继续孵育 10 min; 孵育结束后加入 ABTS2-（ 7. 5 mmol/L） ,3 min 后加入过氧化氢（ 5 mmol/L） ,使总体积为 200 μL,并开始记录 415 nm 处的吸收信号。
　　
　　2 结果与讨论
　　
　　2.1 实验原理
　　
　　所建立的端粒酶检测方法的原理如 Scheme 1 所示。 发卡型（ 颈环结构） 核酸探针（ TM-x） 由 3 部分组成： （ 1） 5‘端悬垂部分与端粒 DNA 互补； （ 2） 颈部包含引物（ TS） 的部分序列； （ 3） 环部是具有过氧化物酶活性的 DNAzyme,且也有若干个碱基被锁于发卡颈部。 在检测条件下，探针 TM-x 将维持稳定的发卡结构，使其不能形成 G-四链体（ G-Quadruplex） ,从而抑制其过氧化物酶活性。 而一旦引物 TS 被端粒酶催化延伸之后，其产物可以通过支点介导链置换作用[17]与探针 TM-x 的悬垂以及颈部杂交，从而破坏后者的发卡结构。 于是，被释放出来的自由 DNAzyme 与 Hemin 结合形成具有催化活性的 G-四链体，进而催化过氧化氢氧化 ABTS2-,产生可被检测的吸收信号变化。 因此，通过检测 415 nm 处吸光度的增加值即可反映出端粒酶的催化活性。
　　
　　2.2 脱氧核酶活性的抑制与恢复
　　
　　由 Scheme 1 所示的检测原理可知，该检测方法的关键是探针 TM-x 中脱氧核酶活性的抑制与恢复，要保证其自身不易形成具有过氧化物酶活性的G-四链体结构，且不受引物 TS 的影响，又要使其易于与端粒酶延伸产物发生链置换反应。 为此，实验首先考察了分别有 1~4 个 DNAzyme 碱基被锁于“发卡颈部”的探针 TM-1~TM-4（ 见图 1） .

　　如图 2（ A） 所示，Hemin 本身催化 ABTS2-氧化的能力很弱，几乎观察不到吸光度的增加，而自由的 DNAzyme 则致使 415 nm 处的吸收值迅速增大，表明该 DNAzyme 具有很高的过氧化物酶活性。 与之相比，本文所设计的 4 条探针的催化活性均出现了大幅降低。 例如 TM-1,尽管只有 1 个 DNAzyme 碱基被锁于发卡颈部，但它所引起的吸光度变化只有自由 DNAzyme 的约 1/15. 结果表明，通过限制 DNAzyme 的构象变化可以有效抑制其活性。 特别是 TM-3与 TM-4 引起的信号变化与 Hemin 相当，表明其 DNAzyme 活性几乎完全被抑制。

　　比较了引物（ TS） 与端粒酶延伸产物（ TS-R2,在引物 TS 的基础上延伸了 2 个 TTAGGG 重复序列）对于探针 TM-x 催化活性的恢复作用。 如图 2（ B） 所示，当 TS（ 200 nmol/L） 存在时，TM-1 与 TM-2 的催化能力均显着增强，从而导致体系的背景信号较高。 而对于 TM-4,虽然 TS 没有使响应信号明显增加，但 TS-R2 的恢复作用也受到了显着影响，因而会降低检测的灵敏度。 这主要是因为较长的颈部序列（ 10个碱基） 使得该发卡结构过于稳定，不利于 TM-4 与 TS-R2 发生链置换反应。 相比较而言，探针 TM-3 一方面受引物 TS 的影响较小，由其所引起的吸光度增加与 TM-3 自身的作用相当； 另一方面当 TS-R2 存在时，吸收信号显着增强，甚至与 TM-1/TS-R2 的结果相近。 图 2（ C） 显示应用探针 TM-3 可以获得最大的 RTS-R2 / TS值（ TS-R2 和 TS 所引起的信号变化的比值） . 以上结果表明，将 DNAzyme 的3 个碱基锁于发卡探针的颈部较好地平衡了酶活性的抑制与恢复关系，使其既不受引物 TS 的影响，又易于与端粒酶延伸产物（ 如 TS-R2） 发生链置换反应，这将非常有利于提高检测的灵敏度。

　　2.3 探针 5’端悬垂长度的影响
　　
　　探针 TM-x 的 5‘端悬垂部分为端粒 DNA 的反义序列，其主要作用是作为支点（ Toehold） 促使端粒酶的延伸产物与该探针发生支点介导链置换反应，从而释放被锁于发卡结构中的 DNAzyme. 理论上，该悬垂部分越长链置换反应的速度越快，新生成的双链结构也越稳定。 但实际上，当 Toehold 的长度超过 5 个碱基以后，链置换速度就不再明显增加[17]. 另外，过长的悬垂部分还会增加探针结构的复杂性。

　　为此，本文比较了不同长度的端粒酶延伸产物对于 TM-3 活性的恢复作用，用以确定适合的悬垂长度。

　　其中，TS-02~TS-08 分别对应于在引物 TS 的基础上延伸了 2~8 个碱基。 如图 3（ A） 所示，TS-08 和 TS-06 对于 TM-3 活性的恢复作用基本相当，同时也与 TS-R2 的作用相似。 但随着延伸长度的继续缩短，其恢复 TM-3 活性的作用明显下降，例如 TS-02 所引起的吸光度增加仅相当于 TS-08 的 1/4. 这一方面是由于有效 Toehold 长度缩短使得链置换反应变慢，另一方面也是因为 TS-02 与 TM-3 所形成的双链不够稳定。 由此可见，能够有效打开 TM-3 发卡结构、恢复 DNAzyme 活性的最短序列为 TS-06,这也意味着只要引物 TS 被端粒酶延伸 1 个重复单元就能引起信号的明显变化，从而在一定程度上提高方法的灵敏度。 根据这一结果，可以适当调整 TM-3 的5’端悬垂长度。 例如，TM-31 与 TM-32 是在 TM-3 的基础上分别删除了 2 个或者4 个碱基。 由图3（ B） 可见，对于 TM-31,体系的吸光度变化与 TM-3 存在时基本相当，而对于 TM-32 则出现了较明显的降低。 这一结果再次证明保持至少 6 个碱基的 5‘端悬垂长度非常必要，因此实验选用 TM-31 作为较优化的探针。
　　
　　2.4 Hemin 及 ABTS2-浓度的影响
　　
　　在完成探针优化后，进一步考察了 Hemin 及 ABTS2-浓度对响应信号的影响。 如图4（ A） 所示，尽管随着 Hemin 浓度的增加，由 TS-R2 所引起的吸收值逐渐增大，但由 TS 所产生的信号也随之增加，并且导致二者比值 RTS-R2 / TS急剧下降[图4（ B） ]. 这主要是因为 Hemin 可以促进 DNAzyme G-四链体结构的形成，因此过高的浓度势必会导致较多的发卡探针被破坏，加之 Hemin 本身也具有一定的催化能力，从而导致背景信号显着增强。 相比较而言，由于 ABTS2-仅作为反应底物，其浓度的增加对于响应信号有积极的影响，不但吸光度值大幅度提高，而且 RTS-R2 / TS值也随之增大[图4（ B） ]. 但当[ABTS2-]超过7. 5mmol / L 时，该比值又开始下降。 因此，较优的 Hemin 与 ABTS2-浓度分别为0. 3 μmol/L和 7. 5 mmol/L.2.5 端粒酶的检测在检测端粒酶之前，先应用 TS-R2 作为端粒酶的模拟延伸产物考察了方法的灵敏度。 如图 5（ A） 所示，利用该方法可以清晰地分辨 20 nmol/L TS-R2 与 200 nmol/L TS 所产生的吸收变化，而且随着 TS-R2 浓度的增加，吸光度值继续增大，并在 20 ~ 100 nmol / L 范围内表现出良好的线性关系。 以上结果表明本方法不但具有较好的信背比，还具有较高的灵敏度（ 检出限比 Xiao 等[16]

　　报道的方法低了 1 个数量级） . 图 5（ B） 显示了应用该方法检测端粒酶的结果，可见它可以检测低至 500 个 Hela 细胞等当量的端粒酶。 这一检出限比 Pavlov 等[15,16]

　　所发展的方法低了近 1 倍。 另外，由于本方法不需要复杂的表面修饰，同时受细胞自身端粒 DNA 的影响较小（ TM-x 探针只能被 TS 延伸产物打开） ,因而将更适于肿瘤细胞内端粒酶的活性分析。
　　
　　3 结 论
　　
　　基于 DNAzyme 与支点介导链置换技术建立了一种端粒酶检测新方法。 该方法简单，不需要荧光标记和复杂的表面修饰，且灵敏度较高，有望在肿瘤细胞的端粒酶活性分析中得到广泛应用。