人类Rab7多克隆抗体的获取

　　Rab蛋白是小分子GTP结合蛋白家族 (由Ras、Rho/Rac/Cdc42、Ran、Sar/Arf、Rab等亚家族组成)中最大的亚家族,由Novick等于1980年首先发现.研究表明,Rab存在于所有的真核生物中,在进化过程中高度保守,但在不同物种中又表现出数量和功能多样性.目前,在人类已发现约70种Rab蛋白和Rab样蛋白.

　　Rab蛋白由200个左右的氨基酸组成,是一种单体形式的GTP结合蛋白.Rab蛋白由保守的G结构域和高度可变的N端和C端组成,其家族成员的氨基酸序列的相似性在35%~80%之间.Rab蛋白在体内有两种构象:与GTP结合的Rab蛋白处于活化的状态,位于胞膜;未活化的Rab蛋白与GDP结合,位于胞浆.

　　作为囊泡运输的分子开关,Rab蛋白在非活化和活化状态之间不断转换,在囊泡的形成、转运、粘附和融合过程中起重要作用.Rab蛋白可直接或间接与被运输的分子结合,使其进入囊泡.

　　Rab蛋白能聚集于细胞内特定的膜区,通过吸附不同的效应因子而实现与靶膜的结合.

　　最近几年的研究表明,一些Rab蛋白通过囊泡运输参与细胞内信号传导,调节细胞的增殖、分化和凋亡,而有些Rab蛋白甚至直接影响DNA的复制与转录.

　　Rab7属Rab蛋白家族,在早期内体到晚期内体以及晚期内体到溶酶体的膜泡转运中发挥重要的作用.

　　本论文将人类Rab7基因克隆到原核表达载体,通过诱导基因工程菌获得Rab7蛋白,并以此为抗原免疫小白鼠,获得人Rab7多克隆抗体,为进一步研究Rab7的生物学功能奠定基础.

　　1 材料与方法

　　1.1 材料
　　Tripure Isolation Reagent购自Roche公司,M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit为TaKaRa公司产品,质粒DNA提取试剂盒和胶回收试剂盒购自Omega公司,Glutathione Sepharose 4B、ProteinAagarose购自GE公司,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)购自Sigma公司,表达质粒pGEX-4T-2和大肠杆 菌DH5α菌 株 由 本 实 验 室 保 存,引 物1:5’AAGGATCCATGACCTCTAGGAAGAAAG 3’(BamHI)和引物2:5’AAGAATTCGCAACTGCAGCTTTCTGCC 3’(EcoRI)由生工上海有限公司合成,Taq DNA聚 合 酶、dNTP、EcoRⅠ酶、BamHⅠ酶、T4DNA连 接 酶、蛋 白 质 标 准marker购 自Ferments,DNA marker购自上海生工,其他试剂均为国产分析纯.
　　
　　1.2 方法
　　1.2.1人肾胚细胞HEK293RNA的提取与逆转录将培养瓶中培养的HEK293细胞吸去培养基,直接加入1mL的Tripure,吹打几次使细胞完全裂解,然后转入1.5mL的Ep管中,根据使用说明提取总RNA,然后用50μL的经DEPC处理的灭菌去离子水溶解.取4μg总RNA,根据M-MLV ReverseTranscriptase的说明进行逆转录获得HEK293细胞的cDNA.

　　1.2.2 Rab7基因的重组表达常规方法扩增Rab7基因,PCR扩增条件为:94 ℃预变性3min,94 ℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸45s,共38个循环,再于72℃继续延伸10min.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后,回收目的片段.

　　用EcoR I,BamH I酶切PCR产物和pGEX-4T-2质粒,然后回收酶切产物,在24℃下用T4DNA连接酶连接30min,连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,涂到含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上培养16h,菌落PCR方法挑选阳性克隆,PCR条件同上.

　　选取阳性克隆培养,提取质粒,通过双酶切法进一步检测,阳性菌落送生工测序.

　　检测与测序正确的菌株接种到5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中,37 ℃下振荡培养过夜,第二天按1∶50的比例接种到新鲜的培养基中培养至生长对数期(约4h)后取出,放至室温后加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半苷(IPTG),诱导剂的终浓度为0.25mmol/L的,然后将不同的菌液分别在不同温度下继续摇培4~6h进行目基因的诱导表达.

　　离心法收集菌体,菌体用冰冷的PBS重悬,超声破碎裂解细菌,10 000× g离心10min,对离心后的上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析.

　　1.2.3 Rab7重组蛋白的纯化将含重组质粒的DH5α菌接种于500mL LB液体培养基,加入IPTG后在24℃继续摇培6h.离心收集菌体,加入预冷的15mL 1×PBS缓冲液,冰上超声裂解细菌.裂解液4℃下10 000× g离心20min,将离心后的上清液与Glutathione Sepharose 4B结合30min,将结合液装到层析柱上,用1×PBS洗去杂蛋白,然后用洗脱缓冲液(50mmol/L Tris-HCl,10mmol/L GSH,pH8.0)洗脱目的蛋白.通过SDS-PAGE法鉴定融合蛋白的纯度,用Bradford法测定蛋白质浓度.

　　1.2.4 Rab7多克隆抗体的制备取抗原200!g,加入弗氏完全佐剂(后3次用不完全佐剂)振荡混合4~6h至抗原完全乳化.选取10只7~12周的BALB/c雌鼠进行免疫注射,共注射4次,每次间隔10d.最后一次注射后第4天采血,用1.5mL Ep管收集鼠血,放置在4 ℃冰箱中过夜.第二天,4 ℃ 2 000g离心10min,吸取血清,分装成小管放在-80℃冰箱中保存.使用时用Protein A agarose亲和柱分离抗血清中的IgG.

　　1.2.5 酶联免疫分析(ELISA)设置正常处理(抗原+抗体+二抗)、阳性对照(稀释二抗+底物溶液)、阴性对照(抗原+其他小鼠抗体+二抗)三组反应,按ELISA法常规操作,鉴定Rab7多克隆抗体的特异性和滴度.

　　2 结果与分析

　　2.1 Rab7基因的克隆与表达从NCBI获得Rab7(NM_004637.5)基因的cDNA序列,以HEK293细胞的总RNA逆转录出来的cDNA为模板,用Rab7基因的特异性引物扩增,扩增产物通过1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测,可以在凝胶上看到600bp左右的条带,与预想的PCR产物大小相符合.PCR产物经常规的操作步骤,构建出重组质粒pGEX-4T-2-Rab7,然后转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞,菌落PCR扩增出与预期结果大小一致的特异性条带(图1).【图1】

　　对该重组表达质粒进行双酶切鉴定,也得到一条长约600bp的条带,与预期大小一致,说明Rab7基因已克隆到表达载体上,对酶切鉴定正确的阳性克隆进行测序,使用DNAMAN软件比较此次克隆到的序列和NCBI上的序列,结果表明序列结果正确,没有移码或突变,表明原核表达载体成功构建.SDS-PAGE电泳结果表明,经IPTG诱导表达的重组菌出现一条非常明显的诱导蛋白条带,条带大小在48kDa(图2,箭头所示),此带的大小与Rab7蛋白及与其融合的GST蛋白的分子量(28kD)之和大致相当.【图2】

　　但在对照组(未经IPTG诱导的重组菌株)中看不到该蛋白条带,说明Rab7基因插入表达载体pGEX-4T-2后,在大肠杆菌中获得了高效表达.但在37 ℃下诱导形成不可溶的包涵体.改变诱导温度,发现融合蛋白在24℃条件下部分可溶.选择24 ℃作为诱导温度,重组菌经IPTG诱导4h后离心收集菌体,超声波破碎,GlutathioneSepharose 4B亲和层析纯化.

　　纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE分析以鉴定其纯度,结果在凝胶上只有一条48kDa大小的条带,说明获得了纯度很高的重组融合蛋白(图3).【图3】

　　
　　2.2 Rab7多克隆抗体的制备与检测用纯化的重组表达融合蛋白作为抗原免疫小鼠以获得抗体,然 后 再 用Protein A agarose亲 和 柱 分 离 纯 化IgG.采用ELISA方法来检验抗体的特异性和滴度,用纯化的融合蛋白包被ELISA滴定板,将纯化的IgG梯度稀释后做ELISA鉴定,测定OD450,取2次实验的平均值(图4).【图4】

　　由图可见,将抗体稀释20 000倍后,在450nm处仍有光吸收,即抗体滴度可达1∶20 000,同时,吸收峰在抗体稀释500倍最高,说明抗体的最佳工作浓度(即OD450最高处)约为1∶500.而阴性对照并无明显反应.

　　由此说明所制备的抗体特异性和滴度都是合格的3讨论有研究发现Rab7在早期内体到晚期内体以及晚期内体到溶酶体的膜泡转运中发挥了重要的作用.Rab7还可以通过促进溶酶体的运输还可以清除胞内病毒,Rab7还参与了受体的转运,如将血管紧张素受体表皮生长因子受体转运到溶酶体降解.

　　研究还发现Rab7参与了天然免疫中TLR信号通路.曹雪涛等发现Rab7在Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)信号途径中的重要作用,Rab7促进TLR4转移至溶酶体降解.王娜等发现Rab7抑制了CpG刺激的巨噬细胞中IL-6、IL-1、IFN的表达,该抑制作用的发挥与其酶活性的GTP结合有关,说明Rab7参与了CpG/TLR9信号通路.鉴于Rab7在细胞中的重要作用,本研究旨在获得Rab7的抗体,为后续研究做些铺垫.通过常规的克隆与表达方法,并通过优化诱导条件,本研究获得了纯化的Rab7蛋白,并以此免疫小白鼠,制备了具有良好特异性和较高滴度的抗体.