Red/ET同源重组技术主要内容与运用

　　2001年人类基因组测序完成，基因中所含有的大量的功能信息越来越受到人们的关注。为了解这些复杂的人类密码的含义，对单个基因功能的研究也显得越来越重要。然而，对于真核生物基因片段而言，其序列中除了包含具有功能、能表达的外显子之外，还含有很多调控序列等内含子，如此一个基因片段则可能大至几十或上百Kb.

　　虽然现今有相应的载体，如BAC（人工染色体）和PAC（P1人工染色体）能装载如此大量的基因信息，但是要找到这些基因片段的限制性内切位点，并在体外对其进行长距离的片段扩增的难度比较大[1、2].

　　Red/ET重组技术是以传统的同源重组技术为基础，但是，相对于普通的同源重组技术而言，它具有简单、快速、高效等特点，而且整个重组过程不需要经过体外扩增阶段，这样可以避免外界环境引起的不必要的突变。

　　1 传统同源重组

　　自然发生的同源重组是两个DNA分子之间进行片段交换，从而使序列重排。1956年，在大肠杆菌中，A John Clark发现了两种与同源重组有关的酶，RacA和RecBCD.在同源重组发生的时候，RecA结合DNA单链或双链，对双链DNA进攻，把原来配对的互补链分开，并尝试自身与被入侵DNA链配对。当配对成功后，RecA蛋白脱落。或者在RecBCD的引导下，使目标DNA解旋，以便使外源DNA分子插入并在RecA的帮助下进行重组。当两条链发生重组时，会产生holliday中间体，该中间体在重组完成时由RuvAB和RecG蛋白进行拆分。至此，形成两条含有异源序列的双链DNA.在质粒或噬菌体转入大肠杆菌的实验中，当同源区段小于75bp时会使重组率显着降低。但是实际上，在RecA重组系统中，要求同源臂的长度在1kb左右，且反应条件要求比较苛刻。

　　2 Red/ET 同源重组技术

　　Red/ET同源重组系统，其实是Red同源重组系统和ET同源重组系统的总称，其中ET系统于1998年由Stewart等在大肠杆菌中诱导的Rac噬菌体中发现，随后又在λ噬菌体中发现了Red系统。在这两个系统中，整个重组过程由DNA重组酶参与而不需要限制性内切酶，且对同源臂长度的要求低，仅需35-50bp的同源序列，而传统的RecA同源重组则需要大约1kb的同源序列。并且该系统介导的整个同源重组过程都是在细内进行，避免了因胞外反应引起的不必要突变。

　　2.1 ET 同源重组系统

　　该系统于1998年由Stewart等在大肠杆菌中诱导的Rac噬菌体中发现，其所需的单侧同源臂长度仅为35-50 bp,该噬菌体通过表达蛋白RecE和RecT来介导重组反应。其中RecE蛋白有5′-3′外切酶活性，能够从5′-3′端依次切下双链DNA上的碱基，使DNA分子形成3′粘性末端。RecT是一种单链结合蛋白，保护单链核苷酸不被降解，能在退火时指导单链入侵。在ET系统中，带有同源臂的外援DNA分子可以直接通过同源臂找到同源区域，然后进行DNA的互换。

　　2.2 Red 同源重组系统

　　Red重组系统也是由Stewart的实验小组在λ噬菌体中发现，它是由Redα和Redβ两种蛋白组成的同源重组系统。Redα由三个蛋白质亚基组成，中间的空隙能消化DNA分子，与ET系统中的RecE蛋白相似，它具有5′-3′端核酸外切酶活性，能形成3′粘性末端。

　　Redβ也是一种单链结合蛋白，作用相似于ET系统中的RecT蛋白。

　　3 重组原理及操作

　　3.1 Red/ET 同源重组的原理

　　根据Red/ET中Redα及RecE、Redβ及RecT的功能，推测了该同源重组系统的作用机理。当带有同源臂的外源DNA分子进入到大肠杆菌中时，Redα或RecE发挥其5′-3′端核酸外切酶功能，由5′端开始降解DNA序列，产生的3′粘性末端，这时外源DNA具备了与受体DNA发生重组的条件。产生的粘性末端被RecT或者Redβ结合35bp的单链核苷酸序列，同时防止被细胞内存在的核酸内切酶降解[i].在DNA退火时，含有粘性末端的3′单链进攻双链DNA片段，重组。发生重组的两条DNA链经过剪切和DNA聚合酶的修复作用后，重组DNA形成，外源DNA成功导入受体DNA中[3].

　　3.2 操作方式

　　该重组技术在的操作方式主要有两种。（1）建立含有将γ基因的ET系统或Red系统的质粒，在实施重组时将三者共同导入受体分子中，共同表达。（2）直接在受体菌中筛选出能进行Red/ET重组的菌株。前者的重组成功率更高，但是当受体分子不容易接受外源DNA时，后一种方式就显得更加便捷。

　　4 系统优化

　　最初Red/RT系统采用的是pDAB-ETγ依托型质粒载体，在该载体中，recE、recT以及γ基因分放在PBAD、EM7和Tn-5启动子下共表达。在之后构建的pDAB-ETg和pDAB-gba载体中，RecE/RecT/Redγ和Redα/Redβ/Redγ被放在PBAD启动子后面共表达，该启动子受L-阿拉伯糖诱导调控。但是在实际应用过程中却发现了一些问题。

　　首先，在发生重组后该载体不容易从宿主细胞中去除，影响后续的研究工作。为此，研究人员开发了温控性质粒。其原理是将Redα/Redβ与γ基因放在含有PL启动子和cI857基因的载体上，然后导入大肠杆菌中表达。在温度为30℃时，cI857基因启动PL启动子，使Red系统不表达。当温度为42℃时，cI857基因的作用被抑制，Red系统得以重新表达。

　　其次，由于工程用大肠杆菌一般都缺乏RecA蛋白，在这样的情况下重组的发生率会降低。在最初的目的中使RecA缺失，其目的是为了让真个表达系统中外源DNA复制更稳定。但是为了避免RecA缺失对重组率的影响又从新引入了RecA蛋白[3].

　　再次，γ基因在表达的过程中不易控制，它的过度表达会影响RecBCD的活性，进而影响质粒表达的稳定性（Gam蛋白与RecBCD蛋白结合只是抑制了RecBCD对核酸的降解能力，但仍然能对同源重组起促进作用）。为了解决这样的问题，研究者将γ基因和Red/ET系统共表达，从而对γ基因进行调控。

　　此外，有研究发现，γ基因上的5′端的非翻译区域对重组效率有很大的影响。将含有5′端的非翻译区突变的基因与Redα和Redβ连接，可以很大程度的提高重组效率。

　　5 在载体构建中的应用

　　2006年Osterrieder[ii]等运用Red/ET系统和反筛选系统（I-SceI蛋白）设计出了两步重组方法。首先设计一个含有I-SceI同源臂的基因片段，通过Red/ET系统转入载体之中。构建好的重组载体通过诱导I-SceI蛋白的表达，使双链产生切口。切口处可作为同源臂，进行下一次的异源重组。这种两步重组系统大大的提高了重组的精确性。

　　在对致病菌基因的研究中，朱善元等对禽致病大肠杆菌的ibeA基因进行缺失，用缺失该基因的大肠杆菌粘附与侵袭人微血管内皮细胞。结果显示，缺失ibeA基因的大肠杆菌与微血管内皮细胞的粘附能力显着下降，侵袭率也显着下降[4].Murphy等还通过该技术对致病大肠杆菌的有毒基因进行敲除，以为免疫制剂的进一步研究提供理论方法[5].

　　兰德松等，利用Red/ET同源重组技术，通过两步重组法构建了禽流感A/Goose/Guangdong/3/96（H5N1）毒株的血凝素（HA） 基因的重组火鸡疱疹病毒。他们的研究为新型禽流感重载活性疫苗的开发奠定了基础[6].

　　6 展望

　　Red/ET同源重组技术的使用，为外源基基因的重组表达提供了一种快捷、简单的方法。在抗生素的开发中，使抗生素异源表达，提高产量也是研究中的重点。该技术除了能方便的运用于抗生素的异源表达方面，还可以通过对基因簇的修饰、重排、删除等来创造新的抗生素。现在已有该方面的研究。

　　参考文献

　　[1]Zhao S. A Comprehensive BAC Resource[J]. Nucleic AcidsResearch, 2001, 29（1）： 141-143.

　　[2]马先勇，姚开泰。同源重组技术研究进展[J].生物工程进展，1996,16（3）：16-23.

　　[3]王军平，张友明。Red/ET重组及其在生物医学中的应用[J].生物工程学报，2000,18（12）：502-506

　　[4]朱善元，王健，左伟勇等。禽致病性大肠杆菌ibeA基因缺失及特征分析[J].中国兽医学报，2009,29（12）：1578-1581.

　　[5]Murphy KC, Campellone K G, , et al. Lambda Red-MediatedRecombinologenic Engineering of Enterohemorrhagic andEnteropathogebic E. coli[J]. BMC Molecular Microbiol, 2003, 4（1）：1-12.

　　[6]兰德松，石星明，王云峰等。利用Red/ET技术构建表达H5亚型禽流感病毒HA 重组火鸡疱疹病毒[J].微生物学报，2009,49（1）：78-84.