微藻不同的分离方法概述

　　化石燃料的消耗和全球环境污染的加剧，使可再生、无污染的新能源开发与利用成为研究的热点[1,2].生物柴油具有清洁性、可再生性的优点，近年来受到研究者们的广泛关注[3].生物柴油是以动物油脂（牛油、猪油）、植物油脂（大豆油、玉米油，油棕）或者微生物油脂（微藻）等可再生的生物材料为原料的含氧清洁燃料，其主要组成成分是与石油柴油性能非常相近的脂肪酸甲酯。与石化柴油相比，生物柴油具有良好的燃烧性，高效的能量转化率，优良的润滑性和较高的安全性等众多优势[4].

　　它是一种无毒燃料[5],可以被生物降解，是优质石化柴油的理想替代燃料。

　　美国能源专家如此评价：生物柴油拥有比食盐还小的毒性，比糖类还快的降解速度。微藻具有资源丰富、生长迅速、油脂含量高等优点，将成为生产生物柴油的重要的油脂来源[6,7].微藻是以快速生长和高能源含量着称的单细胞光合有机体，微藻能有效利用太阳能，将 H2O、CO2和无机盐转化为有机物，是地球上最古老的初级生产者之一[8],是最大的自养类微生物植物[9].微藻不仅在水生生态系统如湖泊，河流和海洋中生长，而且也在极端环境如火山水和盐水域中生长[10].我国的海岸线长，有广阔的沿海和内地湖泊水域地区，为我国发展微藻柴油有着巨大地域优势[11].微藻富含糖、氨基酸和高不饱和脂肪酸等，可以用于生产膳食补充剂、动物饲料、生物燃料和一些高附加值的生物活性成分[12].

　　微藻在自然界分布广泛并且种类繁多，其中许多种类不仅能利用二氧化碳进行光能自养生长，同时也能利用有机碳源进行异养生长来获取微藻生物质[13].但是自然水体中的多种微藻混合存在，采集的水样中同时还有浮游动物（摄食者）和菌类，必须先将单个藻细胞分离出来，获得单细胞克隆，才能够保存和培养，进行深入研究。因此如何从原始水样获得单克隆藻种是微藻培养和应用的基础和关键环节[14,15].

　　一般来说，获得单克隆藻种需要经过水样采集、预处理及分离等流程。本文从原始水样的采集、样品的预培养、纯藻种的分离三个步骤对微藻不同的分离方法进行了概述。

　　1 样品采集

　　微藻的种类繁多，广泛的存在于自然水体中，众多种类的微藻在自然界中存在的形式也不同，有的属于浮游种类，有的属于底栖附着种类[16].不同类别的生长的生态环境不一样，因此采集的地点和方法、季节会有所不同。比如，金藻、硅藻常在低温的季节出现，并且硅藻常附着在水体的岩石上，采集时需要用工具刮去藻体后放在采样瓶中。又比如，蓝藻通常喜欢在高温的条件下生长，因此适合于夏季采集。有些藻类的分布还与水体的环境质量相关，眼虫藻、衣藻、卡德藻等常在含有较多有机污染物的静止水中出现。团藻、绿藻、蓝藻、裸藻主要存在于在中度污染的水体中， 硅藻类、金藻类和甲藻类主要在清洁的水体中可以找到[17].此外，还可以利用藻类的趋光性进行初步分离采集的藻种样品，例如可以利用颤藻的趋光能动性将其与采集附着的泥沙分离[18].总之，要得到尽可能多的微藻藻种，需要我们在采集过程中不断摸索，不断的进行经验积累。

　　不同藻类所需的采集工具和方法也不同，浮游藻类可以采用25#浮游生物网进行采集，将采集的藻放在装有培养基的样品瓶中，也可用采水器进行采集获得。常附着在水中岩石或者其他附着物（枝叶、水草）上的底栖藻类采集时可用铲子将藻标本刮取下来放在样品瓶中带回实验室。对于一些容易在短期内死亡的鞭毛藻类采集时应放在装有培养液的样品瓶中，并在短期内进行培养分离[19].

　　2 样品的预培养

　　由于采集的样品中目标藻种的密度可能比较低，分离难度比较大，分离培养也容易造成死亡，因此最好先对采集样品进行预培养。预备培养主要包括样品的预处理和样品的富集培养两个步骤。

　　2.1 样品的预处理

　　从野外采来的水样有时杂质比较多，有的含有沉积物、丝状巨藻或者纤毛虫等原生动物，如果直接用来富集培养和藻种分离，往往会导致藻种富集预培养的失败，因此必须对采集的水样进行初步的预处理，一般采集的水样用 300 目的网绢进行过滤，过滤后的样品再进行富集预培养。

　　2.2 样品的富集培养

　　一般来说用处理过的初始样品直接进行分离，由于样品中藻细胞密度比较低，因此容易造成分离培养的失败，为了避免直接对采集样品分离培养的失败，可先对过滤处理的样品进行富集预培养，使样品中的藻细胞达到一定密度后有利于目标藻种的分离培养。

　　根据所要分离获得的目标藻种的种类来选择适合不同目标藻种的生长条件和培养来进行培养，一般来说淡水中绿藻可以采用 SE 和 BG11 培养基，蓝藻采用 BG11 培养基，硅藻可以采用 D1 培养基，对于海水藻可以采用 f/2 培养基。同时为了获得尽可能多的目标藻种，我们可以把样品分成若干份，然后分别接种于不同的培养基中进行培养，由于样品中藻细胞浓度比较低，因此培养基中接种原始样品的比例比较高，一般为 1/ 4~1/ 2.对于一些难以获得的目标藻种，可以在培养基中加入适量的土壤提取液和微量元素以加速目标藻种的生长，同时接种的样品中如果含有较多的杂菌影响目标藻类的生长，可以采用添加微量的抗生素和选择性抑制剂的方式来抑制杂菌的生长，从而使目标藻种能够生长起来。培养一段时间后，培养液的颜色稍有变化时，可以用显微镜观察培养液中目标藻类是否占有优势，目标藻类达到优势时便可以进行下一步的分离工作[14].

　　3 分 离

　　3.1 微吸管分离法

　　将玻璃毛细管在酒精灯上加热，用镊子拉成极细的微管。 将微吸管放入水样（标本）的瞬间，毛细管会自动吸入微量的水样，微藻随水样被吸入毛细管，将吸入水样（标本）吹放在载玻片上，在 10 倍或20 倍显微镜下观察，在水滴中找到需要分离的目标藻种，用微吸管再次吸取目标藻种，滴在载玻片上，重复数次， 直到获得单个的目标藻种，移入装有经灭菌的培养基（约 1 mL）的试管中静置培养[15].

　　由于吸取的藻细胞为单个藻细胞，因此该法的优点是仅用分离一次就可以获得单克隆藻种，但是该种分离方法操作起来比较复杂，对于微小的藻细胞不好吸取，所以只适合于细胞较大的藻类[14].同时由于为单个藻细胞培养，细胞密度很低，很容易造成分离培养的失败。

　　3.2 喷雾技术

　　Wiedemanl在上世纪60年代建立了一种简单的分离纯化方法，将待分离的藻液样品放入灭菌的离心管中进行离心，在转速 2 000 r/min 下离心 45~90s,倒去上清液，然后加入灭菌后的蒸馏水或者按上述步骤离心洗涤 10~12 次。将夹断的毛细管插入离心管底部，离心管口用棉花塞住，毛细管要略长于离心管，保证毛细管一部分在棉花之上。用压缩空气经无菌过滤后吹在毛细管内，把从固定的离心管里的藻细胞均匀吹出，吹出的藻细胞均匀喷撒在在提前准备好的装有灭菌的固体培养基的培养皿上。操作完成后，将培养皿放在何时的光照和温度条件下进行培养，一段时间后，培养皿上有单藻落长出后将单藻落用毛细管跳出来接种到液体培养基中培养。

　　3.3 稀释分离法

　　把待分离的经过富集培养的藻液样品用灭菌过培养液进行梯度稀释稀释，稀释倍数根据镜检情况而定，直到镜检时每滴藻液里只有一个藻细胞为止，将稀释后的藻液吸取一滴接入预先准备好的装有无菌的培养液中进行培养，培养一段时间后，当培养液中的藻细胞达到一定密度后进行镜检看藻液是否为单种，若为单种则分离纯化成功，若不纯需要继续纯化直到分离出藻液为单种为止[14,15].

　　此种分离方法操作比较简便，对微藻细胞的大小没有限制，一次可进行多个操作，成功率较高[14,15].

　　3.4 固体培养基分离法
　　
　　3.4.1 平板划线法

　　当藻细胞的直接小于 10 ?m 时，可以采用划平板法或平板涂布分离法进行藻种分离[16].在培养基中加入含量为 1%~2%的琼脂进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后待培养液的温度凉至大约 40~50 ℃时将培养基迅速倒入无菌培养皿中，摇匀后即制成固体培养基备用。将接种环经过酒精灯火焰灭菌后在无菌操作的条件下蘸取少量藻液以划线的方式接入备用的固体培养基中，平板划线可采用平行划线、扇形划线及其他连续划线的方式。划线后的平板在合适的培养条件下培养一周左右挑取单藻落接入到液体培养基中进行培养一段时间后在显微镜下观察是否为单藻株，若不是单藻株继续用上述方法进行纯化，直到获得单克隆藻种为止。

　　3.4.2 平板涂布法

　　该方法与平板划线法相类似，只是接种时是将稀释的藻液用涂布棒均匀的涂在灭菌的培养基表面上。涂布后的平板放在合适的条件下进行培养一段时间后，继续上述平板划线法中的镜检步骤，直到获得单克隆藻种为止[20].

　　4 结束语
　　
　　在自然环境中存在大量具有开发利用价值的高效产油微藻，如何从自然界水体中获得高品质优良品质的微藻是微藻研究工作一个亟待解决的问题；同时在微藻的培养和应用中，由于种种原因，所培养的纯藻种易被其他的杂藻或微生物污染，如果不及时分离纯化会导致后续培养的失败，因此采取合适的分离方法对藻种进行分离是至关重要的[15].科研工作者只有熟悉不同藻类的生态特征才能选择正确的分离方法获得优良的目标藻种。