扬子鳄是我国特有的一种鳄鱼，它既古老又数量稀少，是世界上濒临灭绝的爬行动物，被称为“活化石”.因此扬子鳄的研究对于古代爬行动物的兴衰和生物物种的进化，具有重要的意义。纹状体是扬子鳄端脑基底中枢部的重要组成部分之一，其内AChE和SOMmRNA阳性神经元的分布尚未见有报道，本实验采用组织化学法和原位杂交法对扬子鳄纹状体内AChE和SOMmRNA阳性神经元的分布和这两种神经元的形态特征进行观察，为扬子鳄脑的比较解剖学积累相关资料，并且为进一步研究扬子鳄纹状体的机能提供形态学资料。
材料和方法
1.实验动物
7岁龄扬子鳄5条，由安徽省扬子鳄繁殖研究中心提供。
2.方法
扬子鳄处死后立即取脑，将脑组织放入含20%蔗糖的固定液内，4℃冰箱过夜，进行连续冰冻切片，片厚40μm,切 片 分 成 两 套，第 一 套 切 片 用0.01mol/L PBS接片，经双蒸水清洗2次，每次3min,然后将切片浸入反应液，在37℃温箱内孵育1h（将①醋酸盐缓冲液pH5.5,6.5ml;②0.1mol/L柠檬酸钠0.5ml;③30mmol/L硫酸铜1ml;④双蒸水1ml;⑤5mmol/L铁氰化钾1ml依次加入混合后，再将碘化硫代乙酰胆碱5mg溶于上述混合液中即成为反应液）。反应结束后将切片用双蒸水清洗2次，每次3min,然后进行贴片、干燥、脱水、透明、封片处理，显微镜下观察。第二套切片先进行切片的预处理：
0.1mol/L PBS（pH 7.2）漂洗5min×3次，0.1mol/L甘氨酸/0.1mol/L PBS（pH 7.2）洗5min,0.4%Triton X-100/0.1mol/L PBS（pH 7.2）漂洗15min,1μg/ml蛋白酶K 37℃处理30min,4%多聚甲醛PB（pH 7.2）冲洗5min,0.1mol/L PBS（pH 7.2）漂洗3min×2次，0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配制）10min,2×SSC冲洗10min;然后进行原位杂交：将切片用灭菌滤纸吸干，并将其放入杂交液（地高辛 标 记SOMmRNA探 针 含 量0.5μg/ml）中，43℃保温12-16h,将漂浮切片挑入4×SSC中，轻轻搅动，37℃漂洗15min,2×SSC（含RnaseA,20μg/ml）37℃漂洗30min,1×SSC,37℃漂洗15min,0.5×SSC,37℃漂洗15min;最后进行显色、封片：0.05mol/L PBS（pH 7.2）漂洗5min×3次，碱性磷酸酶标记地高辛抗体Fab片段，1:1000稀释，37℃水浴1h,0.05mol/L PBS（pH 7.2）漂洗5min×4次，TSM1冲洗5min×2次，TSM2冲洗5min×2次，NBT和BCIP显色液中，室温暗处显色1-36h,0.05mol/L PBS（pH 7.2）漂洗5min×3次，以终止显色反应。贴片、自然干燥、脱水、透明、封片、显微镜下观察。
3.细胞大小的划分细胞胞体直径在10μm以下的为小型细胞，胞体直径在10-20μm之间的为中型细胞，胞体直径在20μm以上的为大型细胞[1].
4.统计处理与分析用Excel进行数据录入，采用SPSS13.0软件进行统计分析。数值变量资料以x珚±s表示，两组之间比较采用t检验；多组之间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK法（q检验）。以α=0.05作为检验水准，P<0.05作为判定有统计学意义的依据。
结果
1.扬子鳄纹状体内AChE阳性神经元的分布及特征扬子鳄纹状体内可见大量AChE阳性神经元，排列密集，胞体轮廓清晰，突起较短。细胞大小以中、小型细胞为主，另可见少量大型细胞。胞体多为椭圆形，圆形次之，三角形、梭形和多角形数量大致相当。
AChE阳性神经元的胞质和突起呈棕红色，胞核染色较淡或不着色（图1、2）。随机选取20张纹状体切片，取1mm2范围进行观察，统计计数（表1、2）。
2.扬子鳄纹状体内SOMmRNA阳性神经元的分布及特征扬子鳄纹状体内可见大量SOMmRNA阳性神经元分布，细胞大小以中、小型细胞最为多见，大型细胞较少。细胞胞体轮廓清晰，胞体多呈椭圆形，还可见少量圆形、三角形、梭形和多角形细胞。
SOM-mRNA阳性神经元胞体内含有蓝紫色颗粒，胞核淡染或不着色呈空泡状（图3、4）。随机选取20张纹状体切片，取1mm2范围进行观察，统计计数（表1、2）。
讨论扬子鳄端脑被侧脑室分为背侧较薄的皮质部和腹侧较厚的基底部，基底部又可以分为背侧区、腹侧区、中心区、隔区，腹侧区为扬子鳄的纹状体部[2,3].
纹状体是皮质下重要的神经核团之一，它和杏仁复合体一起来自胚胎时的纹状体嵴。鸟类以下动物的纹状体是神经系统高级中枢，而在高等哺乳动物，由于大脑皮质的高度发达，纹状体已退居为皮质下中枢地位，其主要功能是对运动及技能的协调。
乙酰胆碱（ACh）是胆碱能神经的化学递质，AChE是ACh的水解酶，AChE可作为胆碱能神经元的标志物[4].生长抑素（somatostatin,SOM）不仅仅是一种神经内分泌激素而且也是一种重要的神经递质，在神经系统中广泛分布。有资料显示SOM和它的SOMmRNA在同一区域的核周体内，因此可以通过测定SOMmRNA来反应SOM在脑内的分布情况[5].纹状体内胆碱能神经元和SOMmR-NA阳性神经元都可以和多巴胺能神经元共同作用[6,7],从而参与运动的调节。本实验观察到在扬子鳄纹状体内均有AChE和SOMmRNA阳性神经元分布，且这两种阳性神经元数量和形态大致相当，提示其内的ACh和SOM两种神经递质可能在扬子鳄的运动功能的控制和调节方面发挥着重要的作用。
有研究报道，在哺乳动物大鼠纹状体内可见细胞数量较多的AChE阳性神经元，呈散在分布，细胞体积较大，胞体呈圆形或多边形[6].大鼠纹状体中可见少量的SOMmRNA阳性纤维和终末，其内有少量SOMmRNA阳性胞体散在分布，多为大小不等的多角形细胞[8];另外在绵羊和仔猪的纹状体中可见SOMmRNA阳性神经元，胞体多呈卵圆形或梭形[9].本研究中观察到两栖爬行动物扬子鳄纹状体内有AChE和SOMmRNA阳性神经元分布，这两种阳性神经元数量较多，排列较为密集，细胞大小均以中、小型细胞为主，可见少量大型细胞。胞体形态有椭圆形、圆形、三角形、梭形和多角形，以椭圆形和圆 形 最 为 多 见。扬 子 鳄 纹 状 体 内AChE和SOMmRNA阳性神经元与以上动物纹状体内这两种神经元在数量和形态上有一定的相似，但也存在着差异，这一特点可能与物种差别及进化程度的不同有关。近年来的研究发现纹状体不仅对运动技能协调至关重要，还参与了许多学习记忆相关的认知功能[10],而且传统认为它是非陈述性记忆如各种运动技能或习惯性学习记忆等活动的主要神经解剖结构之一。另外有研究观察到在哺乳动物纹状体尾侧，围绕苍白球吻侧有一条密集排列的梭形细胞带组成新月形区域，称为纹状体边缘区，研究证实了该区参与了联合型学习、陈述性记忆和长时记忆等活动[11].在大鼠纹状体边缘区中均可见中等大小呈梭形的AChE和SOMmRNA阳性神经元，ACh和SOM这两种神经递质参与了大鼠的认知和学习记忆功能的调节[12,13].那么在处于进化早期的两栖爬行动物扬子鳄脑内是否也存在纹状体边缘区或类似区域，其纹状体内ACh和SOM这两种神经递质是否参与了扬子鳄学习记忆功能，还有待进一步研究。
参考文献
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