周围神经损伤后再生能力差，致残率高，因此对神经损伤和再生的研究是医学领域里科学研究的热点之一。周围神经具有内源再生能力[1]，坐骨神经离断后的再生主要是背根节神经元的轴突再生。L4-6节神经元是联系坐骨神经的背根节神经元[2]，因此，坐骨神经的内源再生能力主要有 L4-6 节的背根节神经元的基因表达控制。然而在众多基因中哪些基因启动和调控神经元的内源再生能力，周围神经再生启动及调控分子调控模式和机理，轴突再生分子理论假说是什么都不清楚。基因芯片在研究基因的表达变化中有快速高效的独特优势，使其成为基因调控研究的强大工具[3-5]。背根节神经元的轴突再生是由基因调控的，进一步探讨轴突再生的分子调控模式和机理，以及轴突再生分子理论具有重要意义。
借助基因芯片用系统生物学方法探讨周围神经损伤与再生过程中背根节神经元的基因表达和调控模式既往未见有文献报道，本文借助基因表达谱芯片技术进行相关研究，以探讨神经再生的分子调控理论学说。
1、材料和方法
1.1、材料 坐骨神经离断模型的构建和表达谱芯片制备，成年雄性 SD 大鼠被随机分成 9 组，每组 6只，复合麻醉剂(xylazine 10 mg/kg, ketamine 95 mg/kg, 0.7 mg/kg acepromazine）麻醉后，左后肢外侧坐骨神经做 1cm 离断，分别在手术后 0h，0.5h，3h，6h，9h，1d，4d，7d 和 14d，取 1 组模型大鼠 L4~6 节背根节神经元，实验设 3 次重复。mRNA 的抽提用 Trizol法（Invitrogen），具体操作参照说明书进行，基因芯片采用 Agilent 大鼠表达谱芯片，由上海国家工程研究中心完成。
1.2、方法 （1）表达谱芯片数据的获取：芯片数据采用 Silicon Genetics’GeneSpring GX Version 10.0(Agilent technologies) 进行归一化（标准化）处理，去掉重复性不好的数据，然后所有数据与对照组（0 h）比较，设定变化倍数大于 2 倍而且 T 检验中 P<0.05的基因为显著差异基因，用于进一步分析。（2）表达谱芯片数据的分析：挑选显著差异的基因进行数据统计，借助 DAVID在线分析软件，对显著差异基因进行 GO（Gene Ontology）生物学过程（Biological Process）功能注释[6]，根据 P值选择核心生物学过程，并筛选出对应的差异基因，进行数据统计。
1.3、统计学处理 应用 SPSS19.0 统计软件进行统计数据分析，所有时间点都和对照组（0 h）进行比较，行 t 检验，P<0.05 表示差异有统计学意义。设定变化倍数大于 2 倍，且 t 检验中 P<0.05 的基因为显著差异基因。
2、结 果
2.1、差异基因数量变化 坐骨神经离断后，近端坐骨神经差异基因的数量表现为先上升再下降的趋势[7]，但背根节神经元呈现为波浪形的增加（表 1），损伤后的 0.5 h 到 3 h 明显增加，6 h 有所下降，9 h又增加到一个相当高的数量，然后又有所下降，在 4d 达最低值，然后又逐渐增加。
2.2、核心生物学过程的差异基因数量变化 相对于对照组（0 h），一些生物学过程，大部分时间点差异基因所反映的变化 P 值都非常显著，如刺激检测（detection of stimulus）、G-蛋白偶联受体的信号通路（G -protein coupled receptor protein signaling path-way）、细胞表面受体连接的信号转导（cell surface re－ceptor linked signal transduction）、防御反应（defenseresponse）、炎症反应（inflammatory response）、免疫反应（immune response）、神经系统过程（neurologicalsystem process）、节律过程（rhythmic process）和轴突生成（axonogenesis）。结合形态学过程变化，我们认为这些是周围神经再生中，背根节神经元比较核心的生物学过程，筛选和运算它们所包含的差异基因。
结果显示（图 1）信号检测和传递的生物学过程，包括刺激检测、G-蛋白偶联受体的信号通路、细胞表面受体连接的信号转导的差异基因数量均表现为波浪形的变化。防御反应、炎症反应、免疫反应除 3 h突然较高外，表现为持续性的增加，而节律过程和神经系统过程均也表现为波浪形的增加，轴突生成除了 3h 外也表现为持续的增加。
2.3、与轴突生成相关的差异基因的表达变化 坐骨神经再生主要是神经元轴突的再生，因此我们专门列举了与神经元轴突生成有关的基因及它们的表达变化。表 2 显示 Lhx4、Nkx2-9、Efnb3、Titf1、Apoa4等基因表现为波浪形增加的变化趋势。Mapk8ip3、Zfp312、Gap43 等在长时间点表达增加。Tnn、Efnb1等基因表现为一开始就表达降低，Notch1、Nefl、Bm－pr1b 等基因表现为长时间点表达降低（表 2）。
3、讨 论
基因表达谱芯片能一次检测大量的目标分子，具有多样性、高通量和自动化的特点。它已成为高效、快速、大规模获取相关生物信息的重要手段，在研究基因表达、疾病诊断和药物筛选中有广泛应用.我们已研究报道了近、远端神经的基因表达模式和生物学过程的变化规律[5，7-8]。而轴突再生的调控、控制中枢的背根节神经元的总体基因表达变化及相应的调控模式尚未见报道。周围神经离断后，背根节神经元具有内源的再生能力[1]。因此探讨神经元内源再生能力的控制因素，解码轴突再生的启动和调控机制，以便能够优化和提高神经元内源的再生能力，对于改善和治疗周围神经再生是非常必要的。
研究发现坐骨神经离断后，近端坐骨神经差异基因的数量表现为一直上升，在 7 天达最大值，然后呈下降趋势[7]，但背根节神经元呈现为波浪形的增加。我们推测近端坐骨神经是神经的直接损伤和再生部位，所以在损伤后表现为稳定的增加。但背根节神经元却是信号的反馈和指挥中枢，波浪形的变化说明背根节神经元在接收信号、反馈和调控中的特点。进一步分析核心生物学过程的差异基因的变化规律，结果显示信号检测和传递及节律相关的生物学过程表现为波浪形的变化。而防御反应，免疫反应，炎症反应和轴突生成表现为持续的增加，这一定程度上反映了背根节神经元在坐骨神经损伤与再生过程中的分子调控模式。我们也列举了与轴突生成相关的基因及其表达变化。
总之，周围神经的内源再生能力和再生过程是被一些核心基因所调节和控制。我们借助基因表达谱芯片，筛选了坐骨神经离断后 L4~6 背根节神经元的差异表达基因，探讨了这些差异基因所反映的核心生物学过程的变化特点，并分析了轴突生成相关的基因及其变化。这些结果一定程度上反映了背根节神经元的分子调控模式，也为后续研究提供了必要的参考。
[参考文献]
[1] Mokarra m N, Bellamkonda RV. Overcoming endogenousconstraints on neuronal regeneration [J]. IEEE Trans BiomedEng, 2011, 58(7): 1900-1906.
[2] Zhou GX, Xie LS, Wang QB, et al. Alteration of P2X3 ex－pression in dorsal root ganglia after sciatic nerve ligation*[J].Neural Regeneration Research, 2007, 2(4): 198-202.
[3] Liang J, Kachalo S. Computational analysis of microarraygene expression profiles: clustering, classification, and be－yond[J]. Chemometr Intell Lab, 2002, 62(2): 199-216.
