高迁移率族蛋白蛋白与胃癌周围神经浸润的关系研究

　　胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，无论经过手术或是联合治疗，预后均较差，五年生存率较低，究其原因主要在于 2/3 的胃癌患者在发现时已出现局部或远处转移。 周围神经浸润（PNI）是指肿瘤侵犯邻近的神经，肿瘤细胞包绕神经纤维，或进入神经束膜内沿其扩展的局部浸润转移现象。 最近研究发现 PNI 是肿瘤的局部扩散方式之一，可能会成为腹部肿瘤继直接转移、种植转移、淋巴道及血道转移之后的第五个独立存在的转移途径，对肿瘤的预后判断有重要的作用。

　　高迁移率族蛋白（HMGB1）是一种非组蛋白染色体结合蛋白， 在真核生物细胞内参与基因转录、DNA 损伤修复等多种生物学行为，被分泌到细胞外可参与炎症反应，可诱导细胞的增殖、分化、迁移及神经轴突的生长，目前已发现它与多种肿瘤的侵袭转移有关。 有研究显示血清中的 HMGB1 水平可用于胃癌的早期诊断，并且有助于胃癌的分期和预后评估,可能作为胃癌早期诊断的靶点。 本研究旨在通过 HMGB1 蛋白与胃癌周围神经浸润的关系，探讨其在胃癌神经浸润中的作用及其对胃癌患者侵袭转移的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 保定市第一中心医院病理科 2008 年 1月—2012 年 12 月胃癌患者存档蜡块， 筛选出伴有周围神经浸润胃癌 50 例和未伴有周围神经浸润胃癌 40 例（对照组），正常胃组织 30 例均取自胃癌根治术（距癌组织边缘≥5 cm），切除胃组织经病理确诊为正常组织。 所选病例均有完整病历资料，术前均未接受过放化疗或免疫治疗。 临床分期采用 2010年第 7 版国际抗癌联盟 TNM 分期标准， 组织病理学分级采用 Bloom-Richardson 系统 Nottingham 改良方案。

　　1.2 方法
　　1.2.1 主要试剂 鼠单克隆抗体 HMGB1 （购自北京博奥森生物技术有限公司），二抗（快捷型酶标羊抗鼠/兔 IgG 聚合物）、DAB、PBS 等实验试剂均购自福州迈新公司。

　　1.2.2 免 疫组织化学方法 采用 EnVision 二 步法,以PBS 替代一抗作为阴性对照。 石蜡包埋的组织 4μm连续切片；二甲苯脱蜡，梯度酒精逐级水化；3%双氧水（H2O2）、甲醇室温下作用 30 min，以阻断内源性过氧化物酶活性；乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液抗原热修复 90 s；按免疫组化试剂盒说明书操作，加上一抗HMGB1,4℃ 孵 育过夜 ， 磷酸盐缓冲液 （PBS） 冲 洗 ；Envision 二抗室温下孵育 30 min； 二氨基联苯胺（DAB）光镜控制下显色，苏木精复染，脱水，风干，中性树脂封片。

　　1.2.3 结 果判断 细胞阳性表达以细胞内出现棕色颗粒为标准， 随机选取 10 个视野， 切片中超过20%的肿瘤细胞出现棕色染色为阳性表达。

　　1.3 统计学处理 采用 SPSS17.0 统计软件进行分析，各组间 HMGB1 阳性率分析采用 χ2检验，组间差异的显着性检验采用 t 检验，P≤0.05 为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 HMGB1 在 各组中的表达情况 HMGB1 蛋 白表达阳性呈棕色，位于细胞质或细胞核内（图 1、2）。【图.略】

　　HMGB1 在伴有周围神经浸润胃癌组织中的表达阳性率为 76.0%（38/50），高于未伴有周围神经浸润胃癌组织 55.0%（22/44）和正常胃组织 30.0%（9/30）中的表达（P<0.05，表 1）。【表1】

　　2.2 HMGB1 表达与伴有周围神经浸润胃癌临床病理学参数的关系 伴有周围神经浸润胃癌组织中HMGB1 阳性表达与临床分期、 有无淋巴结转移及肿块大小呈正相关（P<0.05）；而与患者的年龄无明显相关性（P>0.05，表 2）。【表.略】

　　3 讨论

　　HMGB1 是 HMG 家族成员之一 ， 它是在 1973年由 Goodwin 等发现的一种非组蛋白 DNA 结合蛋白，主要存在于细胞内，在肝和脑组织中主要集中于胞质，在其他组织中则主要集中在细胞核，释放入细胞外可参与介导炎症反应。 有研究证实，在病理情况下， 细胞内的 HMGB1 可主动被分泌到细胞外，而释放到胞外的 HMGB1 可 被表达 RAGE、TLR、TLR4、TLR9 等识别受体的细胞识别参与免疫反应，另外还可参与多种生物学效应，如恶性肿瘤的发生转移、 细胞的增殖分化、 神经突触生长等。

　　HMGB1 在肿瘤的发生发展过程中具有重要作用。 在消化道肿瘤患者中，HMGB1 呈高表达， 与其受体的共表达及肿瘤的浸润深度、淋巴结转移密切相关，且预后均较差， 在 肝癌患者的研究中还发现HMGB1 与临床分期、分级密切相关。

　　肿瘤转移是一个多步骤复杂的过程，也是恶性肿瘤的生物学特征之一，严重影响患者的治疗和预后。 周围神经浸润是新近被发现的影响肿瘤局部扩散的一种新途径， 对肿瘤的预后判断有重要作用，有研究发现 PNI 阳性与肿瘤组织的恶性程度、淋巴结转移及肿块大小等多种病理学参数相关。

　　本研究发现，HMGB1 在伴有周围神经浸润胃癌组织中阳性表达率为 76.0%， 显着高于未伴有周围 神 经 浸 润 胃 癌 组 织 （55.0%） 和 正 常 胃 组 织（30.0%）， 与伴有周围神经浸润胃癌组织淋巴结转移、临床分期呈正相关，与年龄无关，提示 HMGB1可能会通过促进胃癌周围神经生成影响胃癌的侵袭转移， 该作用与 HMGB1 促进肿瘤周围神经的生成有关。

　　胃癌的预后是一个多因素、多步骤协调的复杂过程，抑制周围神经的生成是目前恶性肿瘤临床治疗研究的热点，寻求抗胃癌周围神经生成的有效靶点具有重要意义。 HMGB1 在胃癌的发生发展过程中具有重要作用，并且对胃癌的早期诊断及预后评估有重要意义，且 研究证实 HMGB1 与 神经突触生长有关。 国内外许多研究表明 HMGB1 是一个潜在的靶抗原, 靶向干预 HMGB1 活性在胃癌生物治疗中具有良好应用前景。 本研究显示 HMGB1 在伴有周围神经浸润胃癌组织中表达高于未伴有周围神经浸润胃癌组织，有望在胃癌的靶向治疗及预后评估中发挥一定作用。

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