体外培养肠神经干细胞的方法

　　位于肠道的肠神经系统（entericneuralsys-tem,ENS）是独立于交感、副交感神经的外周自主神经系统。国外研究[1]发现肠道也存在神经干细胞，即肠神经干细胞（entericneuralstemcells,ENSCs）。在国内，本课题组率先成功提取、培养ENSCs[2].ENSCs与中枢神经干细胞生物学特性相比，可能存在对肠管的特异性，易与ENS结合、重建，提高移植干细胞的成活率和移植成功率。因而熟悉、掌握适宜的体外培养ENSCs的方法，对以后ENSCs的生物学特性研究、为移植治疗提供大量和稳定的干细胞来源有重要意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物 孕15d（E15）清洁级SD大鼠，体质量不拘，由中国科学院上海实验动物中心提供，动物质量合格证编号：SCXK（沪）2007-0005.本实验设计符合动物保护条例并经过温州医科大学动物保护委员会批准。

　　1.2 试剂与仪器 主要试剂：纤维连接蛋白（fi-bronectin,FN,Chemicom），DMEM/F12培养基（Gibco），2-巯基乙醇（2-Mercaptoethanol,Gibco），Reti-noicacid（Sigma），重组人碱性成纤维细胞生长因子（humanrecombinantbFGF,Sigma），N2/B27-supplement（Gibco），表皮生长因子（EGF,Sigma），5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU,Sigma）；一抗：小鼠抗大鼠BrdU（CST），小鼠抗大鼠Tuj-1（Abcam），小鼠抗大鼠Nestin（BD）；二抗：DyLight488标记山羊抗小鼠IgG（KPL）。主要仪器：倒置相差显微镜（Nikon），荧光显微镜（Olympus），流式细胞仪（BD）。

　　1.3 实验方法及分组 参照朱利斌等[2-3]建立的大鼠ENSCs分离、培养、纯化及鉴定方法并适当改良，且培养液中未添加鸡胚浸出液（CEE）。方法简述如下：孕鼠颈椎脱臼处死，解剖获得肠管，剪切、消化、过滤、离心后弃去上清，用ENSCs培养基重悬细胞，锥虫蓝染色计数，以1.0×106个/mL接种到预先用FN包被或未包被的25mL培养瓶中，于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，第24小时半量换液，以后每隔2d半量，约每5~6d传代1次，反复传代。

　　1.4 检测指标 选取培养5d的ENSCs作为研究对象（依据第5天的ENSCs形成的神经球中央开始变黑且需行传代培养，此时细胞处于对数生长期转向平台期的特点而选取）。2组细胞进行形态学动态观察，免疫学观察和流式细胞仪检测，包括Tuj-1阳性细胞、BrdU标记的增殖细胞、Nestin阳性细胞百分比。

　　1.5 统计学处理方法 应用统计学软件SPSS16.0进行统计学分析。阳性细胞百分比以 ±s表示，应用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 形态学及免疫学观察 FN包被组：原代培养第5天ENSCs肠神经球几乎是贴壁的、不规则的集落，直径为100nm左右，有部分细胞迁出，集落周围出现极长的突触状连接（见图1），经免疫学鉴定发现集落周围放射丝状物Tuj-1显阳性，提示为神经元轴突（见图3）。肠神经球Nestin显阳性（类似图4），肠神经球BrdU显阳性。

　　未包被组：原代培养第5天单细胞形成典型长神经球，部分悬浮，部分呈半贴壁，背景较干净，神经球间并未出现极长的神经丝，直径几乎接近200nm,球体开始变黑，适宜传代（见图2）。肠神经球中的细胞Nestin阳性（见图4），肠神经球BrdU阳性。2.2 流式细胞仪检测2组阳性细胞百分比 见图5.

　　与包被组相比，未包被组的Nestin阳性细胞百分比显着增加，BrdU标记的增殖细胞百分比显着增加，Tuj-1阳性细胞百分比显着减少（均P<0.05），见表1.【1】

　　3 讨论

　　肠神经元发育缺陷性疾病是小儿外科临床相当常见的一类疾病，可以是局限性，也可以为弥漫性，包括先天性巨结肠、肠神经元发育异常症等[4].近年来国内外研究者成功地在胚胎、出生后甚至成年鼠及人的肠道提取、培养出ENSCs[5].本研究提取同一来源ENSCs,分成用FN包被及未包被2组进行连续培养，对2组ENSCs生物学特性进行全面比较，寻找适宜的培养方式，以易于ENSCs进行大量体外扩增，便于ENSCs移植治疗肠神经元发育缺陷性疾病。

　　形态学观察发现2组细胞存在共同特点：都能从单细胞自我增殖形成ENSCs克隆集合体（即肠神经球）。但2组从形态学及免疫学方面存在较多不同之处：①相对于包被组，未包被组ENSCs黏附能力较差，但仍能呈半贴壁状态。国内许汉鹏等[6]研究发现，脑神经干细胞也存在类似现象，并了解到神经前体细胞在增殖和分化过程中，会表达和分泌多细胞间黏附分子。结合本实验室以往研究[7]发现，来源同体SD胚鼠脑神经干细胞与ENSCs的生物学特性存在类似性，推测ENSCs也可能存在易表达的黏附因子并分泌黏附蛋白，从而使ENSCs具有黏附性，而半贴壁于瓶底。②未包被组原代培养第5天镜下背景干净，克隆球规则，球体直径较大。神经球是单克隆神经干细胞及其各方向不同分化阶段后代细胞的集合，神经球大小反应增殖能力大小[8],说明包被组增殖能力弱于未包被组。③国外Bondurand等[1]提取E11.5胚鼠消化道神经干细胞并用FN包被培养，培养第10天才能形成典型肠神经球，国内肖莉等[9]研究显示胎龄越小，提取的ENSCs增殖能力越强，E11.5增殖能力强于E15增殖能力。然而本研究E15ENSCs培养第5天就能形成典型神经球，反而E11.5ENSCs增殖能力弱于E15,说明包被组中FN具有抑制ENSCs增殖的功能。④相对于未包被组，包被组克隆集合体周围可见大量神经丝出现，经免疫学鉴定为神经元特异性βIII微管蛋白，此微管蛋白作为分化早期的神经元标记[7],说明包被组FN促进ENSCs分化为神经元等子代细胞。

　　流式细胞仪检测发现，未包被组ENSCs表达Nestin及BrdU标记的增殖细胞含量显着高于包被组，但BrdU阳性细胞变化幅度明显高于Nestin阳性细胞变化幅度。Nestin是神经干细胞表达的一种中间丝状蛋白-神经巢蛋白，目前被公认为神经干细胞的特征性的生物学标记[7].Micci等[10]认为神经干细胞表达阳性，而祖细胞表达阴性，说明Nestin间接反映ENSCs的含量。而BrdU是一种只能在细胞分裂增殖期掺入到细胞DNA中的化合物[11],因此是反映细胞增殖情况的最佳指标。神经球是单克隆ENSCs及其各方向不同分化阶段后代细胞的集合[8],提示BrdU合成量间接反映ENSCs及定向分化的祖细胞的增殖分裂能力。相对于Nestin蛋白而言，BrdU指标检测包括了部分定向增殖分化的祖细胞，所以比例幅度相对高于Nestin.本研究同时发现未包被组Tuj-1阳性细胞百分比显着低于包被组，说明与未包被组比，包被组ENSCs增殖能力下降，易分化为神经元等子代细胞。本研究证实FN具有抑制ENSCs增殖、诱导EN-SCs分化的功能。这一结果一方面说明无任何底物添加，更能维持ENSCs增殖，减少其分化；另一方面说明这些底物（如FN等）犹如细胞外基质，有助于了解肠道微环境变化对肠神经系统形成的影响；再者，研究体外药物干预对ENSCs增殖分化影响时，往往忽略贴壁底物本身会对ENSCs分化起重要作用，从而对研究结果判定产生偏差。

　　参考文献：

　　[1] Bondurand N, Natarajan D, Thapar N, et al. Neuron and gliagenerating progenitors of the mammalian enteric nervoussystem isolated from foetal and postnatal gut cultures[J].Development, 2003, 130（25）： 6387-6400.
　　[2] 朱利斌， 刘征吉， 李仲荣， 等。 大鼠肠神经干细胞分离和体外培养的初步研究[J]. 温州医学院学报， 2007, 37（1）： 5-8.
　　[3] 朱利斌， 刘征吉， 王爱和， 等。 大鼠肠神经干细胞体外培养和鉴定[J]. 中华实验外科杂志， 2007, 24（1）： 122.
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　　[9] 肖莉， 高亚， 刘勇。 比较胚胎和新生小鼠肠神经嵴干细胞体外增殖分化的实验研究[J]. 中华小儿外科杂志， 2007,28（2）： 73-77.
　　[10] Micci MA, Pasricha PJ. Neural stem cells for the treatmentof disorders of the enteric nervous system: strategies andchallenges[J]. Dev Dyn, 2007, 236（1）： 33-43.
　　[11] Nakamura S, Takeda Y, Kanno M, et al. Application of bro-modeoxyuridine （BrdU） and anti-BrdU monoclonal anti-body for the in vivo analysis of proliferative characteristicsof human leukemia cells in bone marrows[J]. Oncology,1991, 48（4）： 285-289.