牛胎儿脑组织中分离培养神经干细胞

　　1992年，Reynolds等[1]从成年小鼠脑纹状体中分离出了能够在体外不断进行分裂增殖并且具有多种分化潜能的一类细胞群，“神经干细胞 （Neuralstem cells,NSCs）”的概念由此被正式提出。近年来，羊驼毛囊干细胞分离、培养与鉴定方面的研究已见报道[2].本 试 验 从 牛 胎 儿 脑 组 织 中 分 离 培 养NSCs,旨在为核移植制作克隆牛提供供体细胞和为制作转基因牛提供受体细胞。

　　1 材料与方法

　　1.1动物材料牛胎儿采自西安某屠宰场。将采取的牛胎儿（保持羊膜完好无损）放置于加有双抗的冰壶中，4℃快速运回实验室。

　　1.2主要试剂Neurobasal Medium（Invitrogen），Supplement B27（Invitrogen），bFGF、EGF和Tryp-sin（Sigma），BSA和FBS（GIBCO）,Neuronal ClassⅢβ-Tubulin（Tuj1）抗 体 （AT809）、Nestin抗 体（AN203）和GFAP抗体（AG259）（碧云天），Anti-SOX2antibody、Anti-Nanog antibody、Anti-Oct4antibody和Ant-SSEA4antibody（Abcam），免疫染色套装、FITC标记山羊抗小鼠IgG（H+L）、Cy3标记山羊抗小鼠IgG（H+L）和Cy3标记山羊抗兔IgG（H+L）（碧云天），DAPI细胞核染色工作液（上海罗氏制药有限公司）。

　　1.3主要溶液配制1.3.1无钙镁PBS缓冲液称取NaCl 4.0g、KCl0.10g、Na2HPO40.575g、KH2PO40.10g,溶于500mL超纯水，121℃高压灭菌，封口膜封口，4℃保存。

　　1.3.2胰蛋白酶消化液称取Trypsin 0.25g、EDTA 0.04g、加无钙镁PBS缓冲液至100 mL.0.22μm滤膜过滤除菌，1.5mL灭菌离心管分装后-20℃保存。

　　1.3.3神经干细胞培养液以Neurobasal Medi-um为基础培养基，配制3组不同的培养液，培养液A为Neurobasal Medium+20μg/L bFGF+20μg/L EGF+20mL/L B27+100IU/mL青霉素+100IU/mL链霉素，培养液B为Neurobasal Medium +20mL/mL B27+100IU/mL青霉素+100IU/mL链霉素，培养液C为Neurobasal Medium+20μg/LbFGF+20μg/L EGF+20mL/L B27+10% FBS+100IU/mL青霉素+100IU/mL链霉素。

　　1.4主要仪器CO2细胞培养箱（美国Thermo公司），倒置相差显微镜（日本OLTYMPUS公司），荧光显微镜（日本NIKON公司）。

　　1.5牛胎儿神经干细胞的分离和培养用手术剪剪开羊膜，取出牛胎儿，置于事先准备好的加有无菌PBS缓冲液（含双抗、无钙镁）的10cm细胞培养皿中。用眼科剪沿胎儿头部“人”字缝剪开，剥除脑膜及血管组织，分离出胎儿脑组织，将其放于另一无菌10cm培养皿中，用PBS缓冲液清洗2遍，分别采用机械法和酶消化法处理脑组织，分别以神经干细胞培养液A、培养液B和培养液C进行培养。

　　1.5.1机械法取大脑皮层部分组织移入加有适量PBS的离心管中，用移液器反复吹打至完全散开，200目筛网过滤，离心洗涤后弃去上清液，加入适量培养液，制成单细胞悬液，接种于六孔细胞培养板，加入2mL神经干细胞培养液，在37℃、5% CO2和平衡湿度下培养，2~3d换液1次。等到神经球形成后，每2d在培养液中添加2μL bFGF（20mL/L）和2μL EGF（20mL/L）.

　　1.5.2酶消化法加入0.125%的胰蛋白酶，37℃振荡消化15min,离心弃去胰蛋白酶，加入适量培养液，200目筛网过滤，得到单细胞悬液，培养方式同机械法。

　　细胞培养3~4d后形成悬浮状神经球。待出现大量神经球后便可传代。轻轻震荡培养板，用移液器将细胞悬液转移至4mL离心管中。

　　1 000r/min离心5min,弃去上清液，加入神经干细胞培养液，用移液器反复吹打为单细胞悬液。调整好细胞浓度，将细胞悬液转移至新的六孔板中，37℃、5%CO2培养箱中继续培养。

　　1.6牛胎儿神经干细胞的鉴定1.6.1免疫荧光细胞化学染色鉴定检测的一抗有Nestin（1∶100）、sox2（1∶300）、Nanog（1∶300）、Oct4（1∶300）、SSEA4（1∶300）、βⅢ-tubulin（1∶100）以及GFAP（1∶100），以PBS代替一抗作为阴性对照，操作步骤如下：（1）染色当天，吸尽细胞培养液，收集覆有待测细胞的盖玻片，PBS缓慢漂洗3次，每次2min.

　　（2）免疫荧光固定液固定20min.

　　（3）吸除固定液，洗涤液漂洗3次，每次2min.

　　（4）加入免疫荧光封闭液封闭30min.

　　（5）吸除封闭液，洗涤液漂洗3次，每次2min.

　　（6）滴加适当比例的待测一抗，室温孵育1h,4℃过夜。（7）弃去一抗，洗涤液漂洗3次，每次5min.

　　（8）滴加适当比例的二抗（与待测一抗相对应），室温避光2h.

　　（9）弃去二抗，洗涤液漂洗3次，每次5min.

　　（10）滴加适量DA-PI,染核8min;弃去DAPI,洗涤液漂洗3次，每次2min;荧光显微镜下观察并照相。

　　1.6.2神经干细胞表面标志物鉴定收集神经球，1 000r/min离心5 min,弃 去 上 清 液，加 入 适 量Neurobasal Medium,离心洗涤神经球。加入神经干细胞培养液重悬细胞，接种到预先包被有多聚赖氨酸的载玻片上，37℃、5% CO2培养箱中培养数小时。神经球贴壁后分别进行神经干细胞标记Nes-tin、sox2、Nanog、Oct4、SSEA4等 免 疫 荧 光 鉴 定。

　　具体操作步骤见1.6.1所述。

　　1.6.3体外诱导分化收集神经球，1 000r/min离心5min,弃上清液，加入适量DMEM/F12培养基，离心洗涤收集到的神经球。加入神经干细胞诱导液重悬细胞，种植在预先放置有包被多聚赖氨酸盖玻片的六孔板中。所用的诱导液去除bFGF和EGF生长因子，根据诱导液中是否添加胎牛血清（FBS）将试验分成2组，第1组选用组成成分为DMEM/F12+B27的诱导培养液；第2组选用组成成分为DMEM/F12+B27+10% FBS的诱导培养液。观察在2组诱导液中细胞贴壁及分化的情况。

　　分化培养8d左右取出细胞爬片，进行免疫荧光细胞化学染色，选用βⅢ-tubulin和GFAP抗体来鉴定分化细胞成分。具体操作步骤见1.6.1所述。

　　2 结果
　　
　　2.1牛胎儿神经干细胞的分离培养神经球是神经干细胞悬浮培养状态下的形态标志之一。采用机械分离法进行原代培养，在神经干细胞培养液A的试验组中，细胞接种培养24h显微镜下观察，可见明显的神经干细胞分裂增殖。培养3~4d,神经球形成，呈悬浮状生长。原代培养6d,神经球增多，大小不等（图1A）。在培养液B的试验组中，细胞接种培养24h显微镜下观察发现，细胞分裂增殖缓慢，形成的细胞团簇少。随着培养时间延长，培养液中细胞数量变少，不能很好地形成悬浮状生长的神经球，难以继续传代培养。在培养液C的试验组中，形成的细胞集落容易贴壁分化。采用酶消化分离法培养2d后，显微镜下观察发现大部分细胞死亡，形成的细胞团簇较少。原代培养6d后，显微镜视野中细胞数量很少，形成的神经球形态较小，活性差，而且数量极少（图1B）.

　　传代培养过程中神经球的形成时间、形成方式以及个体形态与原代培养类似（图2A、B）。随着传代次数的增加，细胞增殖变得缓慢，形成神经球的能力不断降低，神经球形成时间逐渐延长，神经球透明度降低。
　　
　　2.2牛胎儿神经干细胞干性标记的鉴定Nestin作为神经干细胞特异性表面标志物，荧光显微镜下观察结果呈阳性（图3A、B、C）。干细胞标记sox2、Nanog、Oct4、SSEA4等免疫荧光鉴定，结果均呈阳性（图4A、B、C;图5A、B、C,图6A、B、C,图7A、B、C）.

　　2.3牛胎儿神经干细胞诱导分化神经球在神经干细胞诱导分化液中培养数小时后贴壁。贴壁的神经球向四周发出放射状条索，部分细胞贴壁并且细胞表面长出细小突起，细胞沿突起不断向外迁移生长（图8）。随着时间的延长，分化的细胞逐渐增多，突起不断增粗变长，彼此相互连接呈网状（图9）.

　　比较2组诱导液中神经球分化情况发现，加有血清（FBS）的诱导液中神经球贴壁分化速度较快，9d左右大 多 数 的 神 经 球 已 经 彻 底 分 化，而 无 血 清（FBS）的诱导液中部分神经球的外形轮廓依然可见。进行GFAP和βⅢ-tubulin免疫荧光染色，结果显示分化的细胞GFAP和βⅡI-tubulin免疫反应呈阳性（图10、11），这表明培养的神经干细胞分化成了星形胶质细胞和神经元。