重组人神经生长因子的表达及其应用

　　神经生长因子（Nervegrowthfactor,NGF）是神经系统非常重要的生物活性分子之一，对调节神经元的生长、发育、分化、存活及损伤神经的再生修复具有重要作用和临床意义[1-2].目前的基础研究表明NGF可应用于神经中毒、周围神经损伤、糖尿病性周围神经病变、老年性痴呆病、帕金森氏病、面神经炎以及神经损伤（包括脊髓损伤、高位截瘫、断指再植和脑损伤等中枢及外围神经系统的损伤）等神经系统疾病，是目前唯一可应用于临床的神经系统蛋白质因子。NGF从早期发现到医学应用的历史过程，已逾半个世纪。人神经生长因子（Humannervegrowthfactor,hNGF）是在人体中发现的一种对正常神经细胞有营养作用，对损伤神经修复机能有调节作用的生物活性因子，它可维持交感神经和感觉神经的生存，促进神经细胞的分化，决定轴突的伸展方向，对促进大脑的发育、神经系统的生长、损伤神经的再生和功能恢复具有决定性作用。

　　1神经生长因子NGF的结构和其应用

　　目前NGF已经被广泛应用于临床医学中，对于治疗正己烷中毒性周围神经病、视神经视网膜损伤等的药效已经得到确认；在糖尿病周围神经病变、面瘫等领域的应用尚在临床研究阶段，因为试验数量及质量等众多因素的影响，其效果有待综合评估[3];这些研究成果是在基础研究的产品开发上建立的。

　　1.1NGF的结构NGF基因转录生成NGFmR-NA,mRNA翻译后先合成NGF的前体蛋白[4].前体蛋白包括长的、短的两种前体蛋白，即7SNGF和2.5SNGF.短的前体蛋白水解加工成2.5NGF,为通常所指的NGF,整个NGF的生物活性全依赖β亚单位。长的前体蛋白水解加工后为7SNGF,是α2βγ2三种亚单位的复合体，相对分子质量为140000左右。目前雄性小鼠颌下腺是纯化NGF和分析其生物活性的主要供体。

　　以α2βγ2形式存在完整的hNGF分子由1个β亚单位、2个α亚单位和2个γ亚单位以非共价键结合而成，分子中还有2个Zn2+,旨在增强复合体的稳定性。β亚单位由两个相同肽链组成，每个肽链含118个氨基酸残基，相对分子质量为26518,pI为9.3,通过非共价键结合构成二聚体。有二硫键存在于6个半胱氨基酸残基之间，对维持NGF的生物活性十分重要；一旦二硫键被破坏，NGF的生物活性将全部丧失。rhNGF的三维结构图见图1.

　　NGF是由两个具有活性形式的双体平行亚单位通过一个平面轴组成，两个单体的接触面是疏水的，通过分布于三个部分的氨基酸残基，二硫键组成NGF单体的疏水核心，rhNGF的平面结构图见图2.

　　近年来人们对NGF结构与神经损伤相关部位的功效有了更广泛深入的研究和认识。如NGF基因变异的影响[5]、NGF的信号传递路径[6]、NGF在炎症疼痛及修复过程中的作用[7]、NGF之间的协同作用[8]、NGF的基因表达影响因子[9]、NGF与受体之间的相互作用[10]、NGF及受体在肿瘤的形成和肿瘤疼痛中的角色[11]、人工神经支架的改良试验[12]以及结合神经生长因子各种载体的基因表达[13]等等方面都开展了研究。随着对NGF功能的了解，对该类药物及NGF拮抗剂药物[14]用于治疗某些慢性疾病或者疼痛也进行了很多试验和探索，但将这些理论成果最终应用于临床，仍有待时日。

　　1.2鼠神经生长因子的开发目前NGF的上市产品主要由小鼠的颌下腺提取获得，而雄性小鼠颌下腺是纯化NGF和分析其生物活性的主要供体。从颌下腺匀浆中，以离子交换色谱分析法，在中性酸碱度条件下，可以分离出NGF.2002年首个小鼠颌下腺提取的NGF获得新药证书；2003年武汉海特生物制药股份有限公司（与武汉大学医学院联合开发注射用鼠神经生长因子）获得试生产批文；2006年厦门北大之路生物工程有限公司（与兰州生物制品研究所有限责任公司联合开发注射用鼠神经生长因子）获得了SFDA颁发的生产批文，商品名为"恩经复";同年SFDA也批准了武汉海特生物制药股份有限公司的注射用鼠生长因子和舒泰神（北京）药业的30μg注射用鼠神经生长因子生产，分别以"金路捷"和"苏肽生"上市；2010年丽珠基团研制的"丽康乐"获批生产。目前注射用鼠神经生长因子主要应用的临床适应证有中毒性周围神经损伤、外伤性周围神经损伤、糖尿病性周围神经损伤、面神经炎、中小面积烧伤和瘢痕整形术中周围神经损伤、自身免疫性周围神经损伤、帕金森综合症等，近年来也开展了更多的适应证和给药方式的临床研究试验，如对前部缺血性视神经病变患者的综合治疗[15]、对脑卒中患者的穴位注射试验[16]、联合电脑中频对面神经炎患者的治疗[17]、治疗腰椎间盘突出症[18]等等。

　　2重组人神经生长因子的表达及其应用

　　重组人神经生长因子（rhNGF）的研发在国外已有二十年之久，国内外学者对其表达体系进行过多种研究，但在产品的纯化和表征方面还有许多问题，目前该研究领域主要集中在高水平表达和有效适应证的应用两个方面。

　　2.1重组人神经生长因子（rhNGF）的表达hNGF分子的β亚基可完全表现NGF的生物学活性，经序列分析发现其N端含有较多的大肠杆菌稀有密码子编码的残基，因此通常原核系统表达hNGFβ亚基只能得到低表达的低活性蛋白。如何通过原核或真核表达系统获得高表达、高生物活性的hNGF是人们一直关注和研究的问题。

　　姜静等[19]等致力于将E.coli体系包涵体表达和体外复性后的rhNGF-β与CHO表达系统分泌的rhNGF-β比较，认为两者具有一致的理化性质和生物学活性，HPLC纯度均大于95%、生物学比活不低于1.8U/ng,显示E.coli表达体系可生产质量均一、生物学活性高的rhNGF-β。王革等构建了表达质粒pPIC9K/rhNGF,转化毕赤酵母，得到高表达、高外泌的工程菌，并确定了纯化步骤，经疏水层析和阳离子交换层析纯化后，获得活性、纯度较高的rhNGF.电泳结果显示，工程菌表达分泌的rhNGF量约为50mg/L,约占外泌蛋白的50%,活性测定结果表明，分泌蛋白的活性约为104U/mL.

　　乐伟等[21]构建了高表达rhNGF的CHO-DG44单克隆细胞株。经过两步法纯化获得了纯度大于98%的精制rhNGF制品，单克隆细胞株在最佳收获时重组人神经生长因子表达水平可以达到50mg/L以上。陈勇等[22]

　　在CHO细胞中共表达二氢叶酸还原酶（DHFR）基因及人神经生长因子β亚基（β-hNGF）基因，并对表达产物进行鉴定和生物活性分析。结果显示人神经生长因子在CHO细胞中得到较高表达，表达量达0.13μg/mL,且表达产物具有良好的生物学活性。

　　李佳楠等[23]构建的rhβ-NGF杆状病毒表达质粒，是利用脂质体cellfectionⅡ将质粒转染至昆虫细胞Sf9中，用转染细胞的上清反复感染Sf9细胞，大量收获含目的蛋白的培养上清，应用离子交换层析和分子筛层析纯化rhβ-NGF,证实重组病毒感染的Sf9细胞可表达rhβ-NGF;纯化的rhβ-NGF蛋白经SDS-PAGE分析，可见相对分子质量约14200的单一条带，纯度大于98%,能与兔抗人NGF单克隆抗体特异性结合，并能刺激神经节突起生长，其比活性约为0.6U/ng,在昆虫细胞中表达了有生物学活性的rhβ-NGF.

　　Xiao等[24]尝试将含整合rhNGF基因的腺病毒分别直接注入到山羊和兔的乳腺中，在羊和兔奶中都检测到rhNGF,其最大含量分别达196.8mg/L、346.0mg/L,实验者认为这是一条利用哺乳动物大量生产rhNGF的可能途径。Fan等[25]在兔骨髓间充质干细胞中表达了rhNGF,其最大表达量达126.8pg/106cells,且有较好的生物学活性。

　　He等[26]使用全基因合成的方法，选择E.coli偏爱的密码子，合成得到了的rhNGFcDNA,将所获cDNA插入表达载体pthioHisA,得到rhNGF工程菌。

　　rhNGF表达水平占菌体总蛋白的10%~20%,并且使用了thioredoxin催化rhNGF复性的创新工艺，将产物分泌、切割、纯化，得到了天然生物学活性正确折叠的rhNGF.

　　姜静等[19]认为，比较而言，哺乳动物表达系统的CHO具有分泌正确装配、折叠与糖基化等特点，其缺点是表达量低、生产周期长，成本高；而E.coli生产周期短、成本低、易线性放大、表达产物以不溶性包涵体存在，若突破包涵体重折叠瓶颈获得构象均一产物将是规模化生产的首选方式。

　　2.2重组人神经生长因子（rhNGF）的应用美国R&D等多家公司已有规模化生产的rhNGF及rhNGF-ELISA检测试剂盒，近年来国内也有不少生物技术及医药公司生产rhNGF检测试剂盒，但均标明仅供科研之用。目前全球许多科学家对rhNGF进行过动物药效学和人体临床试验，如Stuart等[27]1997-1999年对糖尿病性多神经病患者的疗效和安全性进行了随机对照试验，实验模型和II期临床试验的结果均显示了rhNGF治疗外周神经病变的疗效，虽因III期临床试验未能证明rhNGF治疗糖尿病性多神经病具有显着有益的效果，后期主要是引发视网膜退化的加剧而终止了临床试验，但在治疗糖尿病周围神经病变的临床试验中，rhNGF仍是目前唯一被应用的神经营养因子。Ferrari等[28]应用rhNGF的滴眼液梯度剂量法进行的安全性和药代动力学双盲随机临床试验，结果表明该滴眼液的耐受性较好，无不良反应，为rhNGF在眼科的应用奠定了基础。Li等[29]采取rhNGF腺病毒注射的方式对神经压伤受损的小鼠进行的rhNGF基因转移试验表明，rhNGF可以促进神经细胞的再生，与Pa-gani等[30]的类似试验所得出的结果基本相同。

　　Lapchak等[31]进行过一系列关于rhNGF增加突触前神经元损伤、中枢神经元损伤后胆碱功能及对治疗阿尔茨海默症的影响研究；Gu等[32]的小鼠模型试验结果表明，携带rhNGF的微球是治疗阿尔茨海默病（Alzheimer'sdisease,AD）的一条有效途径。

　　戚其学等[33]采用脑内给予rhNGF对阿尔茨海默病模型鼠进行治疗，结果发现治疗后，AD模型鼠的大脑额叶、基底节和海马ChAT活性比未给予rhNGF治疗的对照组有明显升高，神经元凋亡的发生也明显减少，因此认为，rhNGF在AD模型鼠中主要起到恢复病变区胆碱能神经活性，及减少神经元凋亡的作用。

　　3展望

　　从鼠源的NGF的临床使用情况来看，除了注射部位疼痛为常见的副作用外，还偶见荨麻疹、偶至结膜充血或转氨酶升高等。其重要原因是小鼠颌下腺提取获得的NGF由于原料问题，可能一定程度限制了最终蛋白纯度和比活性，现有的上市药品鼠源NGF中较高标准为蛋白纯度（≥98%）、比活性（≥22.5万AU/mg蛋白）。出于对鼠源异质抗原性和病毒污染可能性的考量，目前美国和欧洲等发达国家和地区都不允许用动物组织提取的成分直接作为人用生物制品治疗性药品，这使人们最终会转向使用基因工程手段生产NGF.

　　虽然目前原核和真核系统表达的rhNGFβ亚基这两种方法都存在产量低、成本高、制备工艺不易产业化等问题，但用基因工程的方法生产rhNGF仍是备选方案之一。

　　王妍[4]认为目前rhNGF未在世界上市，可能主要有以下几个原因：①开发难度大。NGF独特的蛋白质空间结构及与其活性之间的关系，使得现有的表达系统暂时还难于保证其稳定高效的表达，阻碍其快速产业化的进程；②用药的途径和方式以及评价标准一直得不到彻底解决；③适应证的有效性验证和安全性评估复杂。

　　综上所述，未来有关NGF的研究及应用发展可能主要在如下几个方向：①深入开展对鼠源NGF的临床应用研究。随着我国注射用鼠源NGF在临床病例使用中的增多，对其总体使用情况有必要开展全面系统的比较分析。按照临床病症类型、年龄、给药方式、治愈程度等进行统计，采用计算机软件等多种技术手段，综合评估使用鼠源NGF的治疗效果和其产生的不良反应。在试验研究基础上，不断改进给药方式，开展综合治疗。在rhNGF上市之前，鼠源NGF还有很大的应用空间；②随着基因工程制备rhNGF的技术工艺逐步的成熟，最终达到规模化生产水平。rhNGF因其化学本质和分子结构具有更高同源性，且生产规模不受动物原料限制，无动物来源的致病病毒污染威胁，具有更大的发展潜力。人们将重点研究如何优化条件，获得稳定高效的表达途径，最终实现规模化生产。rhNGF一旦上市，将有益于无数神经系统患者，创造巨大的经济和社会效益；③NGF功能替代药物的研究应用。从近期文献资料显示，国外相关研究的热点逐渐转向NGF的二肽模拟物[34].也有部分学者认为，NGF的二肽模拟物作为治疗神经损伤的候选药物，在保留其功能的同时，克服药代动力学方面的弱势，减少了NGF治疗过程中经常出现的痛觉过敏、体重减轻等不良副反应，因而具有广阔的发展和应用前景。