硕士论文
中文摘要
目的:针对巴西榥榥木这种研究信息较少的天然药材，本研究拟通过网络药理学、代谢组学和药理学实验相结合的方式，建立一种筛选其药效的实验模式，且为榥榥木后期的研究开发提供实验依据。
方法:
1.通过建立巴西榥榥木的网络药理学来对其药理作用进行预测：基于雨林数据库（http://www.rain-tree.com/muirapuama.htm#.W67_VfZKI2w）及文献检索等方式，获得巴西榥榥木成分 59 种，获取其 CAS 号与名称，使用 sciencefinder 数据库检索 59 个化合物的结构 ，采用 ACD/Lab Percepta 软件将以上述各成分结构进行类药性分析，根据运算结果选择化合物。利用Swisstarget(http://www.swisstargetpredictio.ch/)数据库，依据分子的 SMILES 号进行查找相应靶点，将其下载为 csv 格式并整理相关数据。以 Probability＞0.5 为筛选条件，将满足条件的靶点与其对应成分进行保留。 通过基因间相互作用的预测网站 GeneMANIA(http://genemania.org/)，将靶点信息导入其中，以此构建出PPI 网络。对所建立的 PPI 网络，利用 cytoscape 软件中的 mcode 聚类分析模块，进行核心子网的推断和构建，利用子网中的靶点进行疾病的富集分析，根据富集分析结果预测相关的疾病。
2.运用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF-MS)技术，结合多变量数据分析，探究巴西榥榥木对正常大鼠血浆内源性代谢物的影响及其代谢机制。实验采用巴西榥榥木的高剂量 5g/kg 生药量、低剂量 2.5g/kg 生药量干预正常SD大鼠 。在相同的饲养条件和给药条件下收集血清样本，利用UHPLC-Q-TOF-MS 技术，将双蒸水对照组与巴西榥榥木给药组大鼠血清样品进行代谢轮廓分析。结合正交偏最小二乘判别分析法(OPLS-DA)与偏最小二乘法分析（PLS-DA）等多元统计分析方法，分析巴西榥榥木对正常大鼠代谢标志物的影响，并借助 MetPA，分析药物对大鼠内源性代谢标志物代谢途径的影响，初步阐述巴西榥榥木的靶标范围。
3.对巴西榥榥木醇提物展开急性毒理实验：观察小鼠给巴西榥榥木 281.84g/kg后，1h、24h 与 7d 的体态变化反应、体重变化及死亡状况。在此剂量下，小鼠未表现出毒性作用，可以初步认定巴西榥榥木基本没有毒性。按此剂量范围进行给药。在小鼠适应性负重游泳中，实验分为高剂量组（14g/kg 生药量）、中剂量组(7g/kg 生药量)、低剂量组(3.5g/kg 生药量)三组，持续灌胃 5 天后，将小鼠放入恒温水中进行 3 天的给药负重游泳实验，其负重条件为小鼠体重的 8%，从小鼠落入水中立即开始计时，至小鼠沉于水中，且 10 秒内不能自主上浮，这段时间为小鼠力竭时间。在第 9 天时，对给药后无负重游泳的小鼠摘眼球取血，同时取肝脏和肌肉待测，按试剂盒说明书测定小鼠肝脏匀浆中肝糖原含量、骨骼肌匀浆中肌糖原含量、血清乳酸、血清尿素氮含量与乳酸脱氢酶活性等指标。
结果：
1.将巴西榥榥木成分对接相关靶点，根据靶点预测相关疾病，并分析疾病网络富集结果：基于检索等方式获得巴西榥榥木成分 59 种，根据化合物的结构 ，采用ACD/Lab Percepta 软件分析化合物的类药性分析，将结构导入进行运算，最后导出类药性分析结果，根据结果选择具有类药性的化合物。利用 Swisstarget数据库，依据分子的 SMILES 号进行查找相应靶点，其主要靶点为 Tyrosyl-DNAphosphodiesterase 1 、 Muscleblind-like protein 3 、 Muscleblind-like protein 1 、5-anhydro-D-fructose reductase 等 67 种相应靶点。通过建立的 PPI 网络，利用cytoscape 软件中的 mcode 聚类分析模块，进行核心子网的推断和构建，利用子网中的靶点进行疾病的富集分析，可以得到 Digestive System Diseases、Neoplasms、Neoplasms by Site、Skin and Connective Tissue Diseases、Pathological Conditions, Signs and Symptoms 等 41 种相关疾病。
2.巴西榥榥木乙醇提取物对正常大鼠的给药后血清代谢组学代谢分析：血清代谢组学稳定性分析结果表明，高剂量给药组大鼠的内源性代谢物更加稳定。低剂量组差异更大。在代谢组学研究中，经过血清代谢物检索后，富集并分析差异代谢物的代谢通路，得到 30 个有意义的代谢通路：β-丙氨酸代谢、丙酸盐代谢、酮体的合成与降解、类固醇合成、花生四烯酸代谢和柠檬酸循环等。
3.通过对巴西榥榥木醇提物展开急性毒理实验，结果证实，巴西榥榥木醇提物的灌胃给药最大耐受量为 281.84g 生药/kg；并进行小鼠的负重游泳实验，结果显示与给双蒸水的空白对照组相比，巴西榥榥木乙醇提物给药组的小鼠，负重游泳时间相对更长且具有显著差异性，其中中剂量组和低剂量组能显著减少力竭游泳后小鼠血清中乳酸含量、增加乳酸脱氢酶的活性，且中剂量组血清尿素氮含量显著减少。
结论：
1.通过网络药理学对其药理作用进行分析预测：巴西榥榥木主要成分所对应的靶点主要为雄/雌激素类受体、肌类蛋白、脂蛋白受体、活化肽片段等。根据靶点初步推测，巴西榥榥木可能在能量代谢、性功能、脂存贮等方面有一定的药理作用；根据靶点相关疾病的分析结果，巴西榥榥木可能对于消化系统疾病、肿瘤、肝硬化、呼吸道疾病等有一定的治疗作用。
2.依据代谢标志物变量的显著性和变化强度，初步筛选代谢标志物变量 49 个进行定性分析，通过差异代谢物的代谢通路富集，分析得到 30 个有意义的代谢通路，其中主要可以分为能量代谢、激素类作用、脂类的合成与代谢、氨基酸类代谢四种类型的代谢途径。其中大多直接或者间接参与能量代谢。因此可以说明，巴西榥榥木能够影响大鼠的能量的代谢、氨基酸代谢、脂类物质的代谢、激素合成等。基于血清代谢组学分析，榥榥木参与大鼠体内多条代谢通路，为后期的药效学实验提供可参考的研究方向，为巴西榥榥木的未来开发利用提供科学依据。
3.巴西榥榥木的毒性实验结果证明了巴西榥榥木的安全性，为后期给药方案提供了一个剂量范围；小鼠力竭性游泳后，其体内能源物质的耗竭和某些代谢产物的增加。例如：ATP 的储量下降,血糖的显著性消耗。这些代谢物的变化，可引起中枢性疲劳。抗疲劳作用实验结果证明，巴西榥榥木醇提物在一定剂量范围内，具有的抗疲劳作用，经典药理学的实验结果与网络药理学与代谢组学预测的结果一致。
关键词：巴西榥榥木；网络药理学；代谢组学；毒性研究；抗疲劳作用
A preliminary study on pharmacological action of Muira Pauma- From Brazil
Abstract
Objective:This study aims to establish the composition, network pharmacology of thetarget and disease, and to preliminarily predict the pharmacological effect of paumapauma root, a natural herbal medicine of which there is little information.At the sametime, analysis of the metabonomic and pharmacological experiments of rat blood wasconducted, and the basis of the metabonomic analysis experiment of rats wasestablished to explore the core effect and mechanism of action of this root muirapauma root from Brazil., according to the result of prediction of networkpharmacology and metabonomics, common analysis further determine Brazil muirapauma was possible pharmacological effects, and finally, through a pharmacologicalexperiment Brazilian muira pauma was fatigue experiment, and establish a screeningits effectiveness experiment mode, and validation to confirm its pharmacologicalaction of the feasibility of network pharmacology, and metabolomics ideas, late muirapauma was late for the further study of the research and development of medicinalvalue to provide experimental basis for theoretical basis.
Methods:
1.Establish a network pharmacology of pauma pauma root of Brazil to evaluate thepharmacological effect: 50 components of pauma root, based on the rainforestdatabase (http://www.rain-tree.com/muirapuama.htm#.W67_VfZKI2w) and literatureretrieval, obtain the CAS number and name, and use sciencefinder database to retrievethe structure of 50 compounds, and use ACD/Lab PerceptaSoftware operations will beto import the above composition structure, the export as a result, choose according tothe results of compound using Swisstarget database(http://www.swisstargetpredictio.ch/), on the basis of molecular SMILES to find theappropriate targets, to download it to CSV format and organize related data toProbability>0.5 as the filter condition, will meet the conditions of the target and itscorresponding ingredients to retain GeneMANIA through interaction between geneprediction website (http://genemania.org/) import some targets information, to build aPPI network established on PPI network, using cytoscape McOde cluster analysismodule of software core subnet inference and building, using the target to analyze theenrichment of disease in the subnet, according to the result of enrichment of targetsand predict related disease.
2. The application of super-high performance liquid chromatography coupled withtandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-Q-TOF-MS) combinedwith multivariate data analysis to explore the effect of endogenous metabolites inplasma of normal rats from Brazil, and the metabolic mechanism of muira Pauma rootwas studiedLow-dose intervention in normal SD rats, serum samples, using UHPLC -Q - TOF - MS technique to the control group and Brazil muira pauma was drugmetabolism of rat serum samples contour analysis, combined with partial least squaresanalysis (PLS - DA) and orthogonal partial least-squares discriminant analysis (OPLS- DA), multivariate statistical analysis methods such as analysis on the impact ofBrazil muira pauma was on normal rats metabolic marker and identify with theanalysis of MetPA herbs to endogenous metabolic markers of the metabolic pathwayof rats, this Brazilian muira pauma was the biological mechanism of effects on thebody.
3. The Brazilian muira pauma was alcohol extract on acute toxicity experiment, theBrazilian muira pauma was toxic pharmacological research: a study of the toxicity of281.84g/kg given to a rat, the loss of body mass, weight, and death of a rat within 1hour, 24 hours and 7 days.Muira Pauma - This dose - is of no toxicity to mice andmice given by gavage, and a preliminary conclusion is that the Brazilian dose ofmuira pauma is of minimal toxicity.;The drug is administered within this doserange.In mice as a condition for the construction of fatigue in mice model (adaptiveweight loading swimming), the experiment is divided into high dose group (14 g/kg)content, middle dose group (7 g/kg) content, low dose group (3.5 g/kg) content inthree groups, continuous lavage for five days later, the mice in the constanttemperature water for three days of weight loading swimming experiment, its loadconditions for the 8% of body weight in mice, the mice fell into the waterimmediately began to timing, mice to sink in water, and cannot be independentbuoyancy for 10 seconds, the time can be identified as exhaustion time in mice., andin nine days, the dosage of weight loading swimming 1 h after an pick eyeball bloodin mice, at the same time take the liver and muscles under test, by pressing the kitmanual operation steps to determine the content of hepatic glycogen in liverhomogenate in mice, and muscle glycogen content in skeletal muscle homogenate,and serum lactic acid, serum urea nitrogen content and activity of lacticdehydrogenase.
Results:
1.The analysis of its pharmacological action network pharmacology prediction resultsshowed that through the establishment of the Brazilian muira pauma was networkpharmacology to forecast its pharmacological effects: based on the retrieval methodssuch as Brazil muira pauma was composition 59 species, according to the structure ofthe compounds, use ACD/Lab Percepta software operations will be to import theabove composition structure, the export as a result, choose according to the results ofcompound using Swisstarget database, on the basis of molecular SMILES to find theappropriate targets, the main targets of Tyrosyl - DNACutive-phodiesterase 1Muscleblind-like protein 3 Muscleblind-like protein 1 5-anhydro-d-Fructose reductaseand other 67 corresponding targets were used to infer and construct the core subnetthrough the ESTABLISHED PPI network and the McOde cluster analysis module inthe Cytoscape software, and the targets in the subnet were used for disease enrichmentanalysis to obtain Digestive systemSystem Diseases Neoplasms Neoplasms by SiteSkin and Connective Tissue Diseases Diseases, Signs and Symptoms, etc.
2. Serum metabolomics muira pauma was ethanol extracts of rat serum metabolicanalysis: Brazil muira pauma was serum metabolomics stability analysis results showthat in the high dosage of medicine is endogenous metabolism of normal rats whichhave influence on the stability of low dose is relatively high dose difference biggersample peak out of liquid phase and mass spectrometry conditions suitable foranalysis of the experimental sample to QC sample repeatability characterize thestability of the samples and equipment, through the QC samples of different qualitycontrol during the period of coincidence detection has no obvious change, ion flowdiagram of sample during the test, the sample and instrument has a good stability,after the completion of metabolites retrieval in metabolic pathway analysis, find thebetaAlanine metabolism Propionate Metabolism Valine leucine and isoleucinedegradation of arachidonic acid metabolism Citric acid cycle and other 30 significantmetabolic pathways.
3. An acute toxicity study of an extract of pauma pauma root - this is a study fromBrazil. The results confirm that the maximum tolerable dose of an oral dose of281.84g /kg of raw medicine - pauma pauma root - this root pauma root isnon-toxic.To construct an anti-fatigue model of weight-bearing swimming of a mouse,the results showed that the extract of pauma pauma root had a longer and significantdifference in the duration of a weight-bearing swim compared to a control groupgiven normal saline (P＜0.05), in which the middle dose group and the low dosegroup can significantly reduce the lactate content and increase the activity of lactatedehydrogenase after the exercise of isoleucine mice, and the serum urea nitrogencontent of the middle dose group is also significantly reduced (P＜0.05) Compared tothe control group, a medium dose of the extract, pauma pauma root, from Brazil,significantly increased the duration of swimming (P＜0.01), the lactic acid contentwas significantly reduced (P＜0.05) Lactate dehydrogenase activity increased (P＜0.01), there was no significant difference between liver glycogen and muscleglycogen, and serum urea nitrogen content in the medium dose group wassignificantly reduced (P＜0.05).
Conclusion:
1.Through the analysis of its pharmacological action network pharmacology predictedresults analysis: the Brazilian muira pauma was the main component of the targets aremainly male/estrogen receptor muscle protein lipoprotein receptor activation peptidefragment 1 aldehyde ketone reductase family members B10 according to targetpresumed likely role in energy metabolism, sexual function, its effect on the fatstorage, according to the analysis result forecast targets related diseases Brazil muirapauma was probably cirrhosis of the liver tumor in the digestive system diseasesThetherapeutic effect of respiratory diseases, etc., network pharmacology analysis of thepharmacological effect of the pauma root of Brazil provides a theoretical basis for thedevelopment and discussion of the later study.Therefore, the following differentialmetabolite analysis can be carried out.
2.Based on metabolic marker variables significantly and preliminary screening ofmetabolic changes in intensity mark variable 49 on qualitative analysis of differentmetabolites of metabolic pathway enrichment analysis article 30 meaningfulmetabolic pathways, which mainly can be divided into four kinds of metabolicpathways, which are directly or indirectly involved in energy metabolism, Brazilmuira pauma was in rats serum level can affect the body's energy metabolismhormone synthesis of amino acid metabolism, etc. Has a certain degree ofcorrelationThe analysis of serum metabolomics that Pauma pauma root participates ina variety of metabolic pathways in a rat, which can reflect the internal process of itsinvolvement, thus providing theoretical basis for further research and scientific basisfor the development and utilization of new resources of traditional Chinese medicine.
3.The toxicity study of This root muira pauma root, Brazil, proves that the safety ofthe safety of this root pauma root provides a dose scope for later administration andprovides a theoretical safety benefit to the development of its medicinal value.Afterexhaustion exercise mice, the increase of energy depletion and metabolites ofmaterials: ATP reserves decline, liver glycogen and muscle sugar original significantconsumption, even will cause the loss of blood sugar level, further central fatiguecaused by metabolic product during lactic acid accumulation and lactatedehydrogenase levels increase, the urea nitrogen content increased, therefore, as thebasis of distinguishing fatigue effect anti-fatigue function experimental results provethat its muira pauma was alcohol alcohol extract in certain dose range has theanti-fatigue function, which is consistent with the prediction of networkpharmacology, and metabolomics.
Keywords: muira puama；Network pharmacology; Metabolomics; Toxicity study;Antifatigue action.
目 录
引 言
第一章 基于网络药理学的巴西榥榥木核心药效分析
1.材料
2.方法
2.1 主要化学成分的收集与筛选
2.2 类药性分析
2.3 构建成分-靶点－疾病相互作用网络
2.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）的构建
2.5 靶点－疾病共同靶点的生物过程和通路分析
3 结果
3.1 化学成分信息分析
3.2 类药性分析
3.3 巴西榥榥木成分、靶点筛选结果分析
3.4PPI 网络图构建
3.4 核心子网分析
4 讨论
第二章 基于代谢组学研究巴西榥榥木对大鼠的代谢机制
1 材料与仪器
1.1 实验动物
1.2 试剂
1.3 受试药物
1.4 主要设备与耗材
2 实验方法
2.1 药物配制
2.2 实验动物处理
2.3 血浆样品处理
2.4 液相条件
2.5 质谱条件
2.6 数据处理
2.7 方法稳定性考察
3 实验结果
3.1 血清总离子流图
3.2 系统及样品稳定分析
3.3 代谢轮廓的偏最小二乘法判别分析
3.4 代谢标志物分析
3.5 差异代谢物的代谢通路富集分析结果
3.6 代谢通路分析
4.讨论
第三章 巴西榥榥木小鼠抗疲劳药理作用研究
1.材料与仪器
1.1 实验仪器
1.2 实验药材
1.3 实验试剂
1.4 实验动物
2 实验方法
2.1 巴西榥榥木急性毒性实验
2.2 巴西榥榥木对小鼠抗疲劳作用研究
2.2.4 统计学处理
3 实验结果
3.1 巴西榥榥木醇提物急性毒性实验结果
3.2 巴西榥榥木醇提物对小鼠适应性负重游泳时间影响
3.3 巴西榥榥木醇提物对运动后小鼠生理指标影响
4 讨论
结论
文献综述
1.历史研究状况
2.化学成分研究
3.药理作用研究
参考文献
引 言
中医药在发展过程中不断地吸收国外传统医药体系里临床上有效的动植物药材，如西洋参、番泻叶、乳香、没药等，经过长期的临床实践和研究，如今这些药材及饮片均纳入了中医药体系，且进入了中国药典，极大地丰富了中医药的实践和理论。当今世界，国外传统医药体系里仍然有相当数量的传统药物，由于种种原因没有被充分认识和利用。在地理纬度上与中国没有重叠的巴西，就有这样一批这些的药用植物，在当地被认为是临床有效的，但研究不够充分[1]。本文仅对巴西榥榥木这种植物进行初步的活性探讨研究，以期对其核心药理学功效的阐明提供研究线索。传统的药效筛选方法多依据临床线索，对相应的疾病模型动物直接用药，观察其药效，然后进行统计分析，得出结论[2]。这种方法成功的把握不大，针对性不够强，人力、物力和时间成本均较高，效率比较低。尤其是当临床线索很多、哪个是其核心功效尚不清楚时，对每个功效逐一研究然后进行对比，这种研究令人生畏，似乎无从下手[3]。随着对植物成分、疾病成因、生理机制等系列研究的深入和研究成果的积累，人类攻克疾病可利用的资料越来越多，面临的研究数据越来越宠大[4]。如何合理选择已有研究成果，成为当今科研工作者必须首先解决的问题。随着计算机网络数据库的诞生和发展有了系列的数据库和数据分析工具可以利用，网络药理学应运而生。传统中药学的研究具有系统性和整体性的特点和注重药物之间的相关性，网络药理学的研究思路具有整体性和系统性的特点解决中药的多成分、多靶点和多作用途径的复杂系统[5]。而巴西榥榥木作为巴西以及亚马逊流域著名的道地药材，其在其本土的应用方法与我国传统的中药应用思想具有一定的相似性，因此，将网络药理学引入对巴西榥榥木的研究，对了解巴西榥榥木的药理作用的整体性和系统性有一定的帮助作用。
巴西榥榥木是巴西榥榥木为铁青树 Olacaceae 科，Ptychopetalum 属，olacoides种植物，主要药用部位为树皮和根，常用名有: Muira puama， potency wood，marapuama,marapama,muirat?, muiratam,pau-homen, potenzholz。在当地也被称为“效能之木（potency wood）”[6]，是一种原产于巴西亚马逊和亚马逊雨林区域的一种树木。研究显示巴西榥榥木的主要功效包括：缓解疲劳、增强性欲、 防止溃疡、提高性功能、抗抑郁、增强记忆力、有助于肠胃和生殖疾病、抗风湿等，也可用于缓解压力和治疗创伤，对神经刺激能够安神、 保护脑细胞 、保护脑细胞等，其他的功效包括：缓解疼痛、降低血压、减少疲劳等[7-8]。研究表明其中化学成分多为有机化合物，因此，其作为药用使用时多以酊剂和汤剂的形式。但目前为止，巴西榥榥木的药理作用研究尚不明确，且缺少足够的实验基础研究支持其认为的功效作用。
本课题以巴西榥榥木为研究对象，研究内容分为三部分：1.基于网络药理学的巴西榥榥木的核心药效分析。2.基于血清代谢组学的巴西榥榥木代谢通路分析。3.巴西榥榥木的药效学研究。
实验技术路线见下图：
第一章 基于网络药理学的巴西榥榥木核心药效分析
网络药理学是系统生物学的重要组成部分，具有整体性、系统性和注重药物间相互作用的特点。中药是一个多成分、多作用靶点和多作用途径的复杂系统，它治疗疾病遵循的是整体观思想。因此网络药理学适用于中药的研究，能够为在传统中药与现代药理学之间搭建适宜的桥梁[9-10]。因此，本研究将网络药理的研究手段引入巴西榥榥木的药效作用研究，整体地和系统地揭示巴西榥榥木的药理作用。关于巴西榥榥木药效物质和功效的报道均非常罕见，对其的开发与研究工作具有较强的创新性与前瞻性。
1.材料
雨林数据库（http://www.rain-tree.com/muirapuama.htm#.W67_VfZKI2w）；Swisstarget 数据库(http://www.swisstargetpredictio.ch/)；Uniprot 数据库；基因间相互作用的预测网站 GeneMANIA(http://genemania.org/)；cytoscape 软件。
2.方法
2.1 主要化学成分的收集与筛选
通过雨林数据库（http://www.rain-tree.com/）和大量的文献检索，共获得巴西榥榥木的化学成分 59 种，根据化学式获取其 CAS 号与名称，使用 sciencefinder数据库检索该 59 个化合物的结构，将其转存为 sdf 格式保存。
2.2 类药性分析
药物在人体内需经过 ADME（吸收、分布、代谢、排泄）四个过程才能在人体内发挥作用，这要求对所研究药物的成分必须满足类药性，因此首先需要对巴西榥榥木化学成分进行类药性分析。本实验采用 ACD/Lab Percepta 软件对以上 59 个化学式进行类药性分析，将上述各成分结构 sdf 格式导入软件中，通过软件的分析，最后导出结果，根据类药性选择具有成药性潜力的 58 种化合物。
2.3 构建成分—靶点－疾病相互作用网络
利用 Swisstarget (http://www.swisstargetpredictio.ch/)数据库，依据分子的SMILES 号查找相应靶点，将其保存为 csv 格式，并整理相关数据。以 Probability＞0.5 为筛选条件，将满足条件的靶点及其对应成分进行保留。
2.4 蛋白质—蛋白质相互作用网络（PPI）的构建
为了更好的挖掘巴西榥榥木的药理作用，考虑其作用靶点的复杂性，需要构建药物-疾病-共同靶和与靶点相互作用的蛋白的相互作用网络。并将靶点信息导入基因间相互作用的预测网站，GeneMANIA(http://genemania.org/)构建出 PPI 网络。
2.5 靶点－疾病共同靶点的生物过程和通路分析
为进一步推测巴西榥榥木的核心药理作用，对所建立的 PPI 网络，利用Cytoscape 中的 mcode 聚类分析模块，进行核心子网的推断和构建，利用核心子网中的相关靶点对疾病的富集分析。
3 结果
3.1 化学成分信息分析
通过对下载成分结构进行确认，共得到巴西榥榥木成分 37 个，主要包括三萜类成分和皂苷类成分。
3.2 类药性分析
通过文献检索及巴西雨林数据库的检索，筛选得巴西榥榥木具有类药性成分59 种，见表 1-1。表中包括成分的化学类型、原植物药用部位、植物来源、成分含量，可以看出其主要成分包括脂肪酸、萜类化合物、甾体类化合物、挥发油和氨基酸类化合物等。
表 1-1 榥榥木成分信息表
Tab. 1-1 Information of an element of this rootCompound Chemical type Plant Part
3.3 巴西榥榥木成分、靶点筛选结果分析
根据相关性进行靶点的筛选，共得到满足条件的有意义的靶点 81 个，见表1-2。巴西榥榥木主要成分所对应的靶点为雄/雌激素类受体、肌蛋白、脂蛋白受体、活化肽片段 1、醛酮还原酶等。
表 1-2. 巴西榥榥木成分预测所得靶点表
Tab. 1-2 A potential target of an ingredient of muira Pauma
3.4 PPI 网络图构建
将 81 个有意义靶蛋白导入 GeneMANIA 数据库中，进行蛋白-蛋白相互作用的网络构建和分析，结果如图 1-1。其中较大的节点意味着其在网络内的地位较重要，网络中与其直接连接的蛋白较多，较粗的线意味着两个相邻的蛋白之间有较强的作用关系。其中 81 个蛋白因为它们的相互作用，携带出 11 个潜在的节点蛋白，81 个预测蛋白变为 92 个预测蛋白。
图 1-1 巴西榥榥木预测蛋白 PPI 网络图
Fig. 1-1 A network view of a protein producer - muira pauma
3.5 核心子网分析
利用 cytoscape 软件中的 mcode 模块，对巴西榥榥木预测蛋白 PPI 网络图进行分析。所在核心网络 K 值评分最高的即为出核心网络，将其靶点蛋白导出，利用 cluego 模块进行通路分析，利用 CTD 数据库进行疾病分析，得出巴西榥榥木的相关通路及相关疾病，结果见表 1-3，图 1-2。结果可知巴西榥榥木可能对于消化系统疾病、肿瘤、肝硬化、呼吸道疾病等有一定的治疗作用。
图 1-2 巴西榥榥木预测蛋白核心子网图
Fig. 1-2 A core subnet of a protein of muira pauma
表 1-3 巴西榥榥木相关疾病的预测
Tab. 1-3 An analysis of a related disease of the root muira pauma
4 讨论
巴西榥榥木作为巴西与亚马逊流域一种道地的植物，根据其当地的文献记载和民间的用法，巴西榥榥木有增强性功能、抗疲劳、治疗神经衰弱、抗炎等方面的药理作用，但是相关的研究并不充分，基本未见相关的文献报道。网络药理学，从整体观角度出发，认识药物与机体的相互作用，这种现代生物医药的研究模式恰恰与中医药的整体性观念不谋而合。近几年来，利用网络药理学对中药作用机制的研究也越来越多。
本文运用网络药理学的方法，构建了预测作用靶点和靶点相关蛋白质之间PPI网络，得到了一些可能与巴西榥榥木药效的靶点。基于 Cytoscape 3. 2. 1 软件，对这些靶点进行聚类分析，结果显示，巴西榥榥木可能用于消化系统疾病、肿瘤、骨骼肌疾病、肺部疾病以及生殖系统相关的疾病等；可能药理作用为增强性功能、抗疲劳、抗焦虑等作用。由巴西榥榥木的历史使用方面，多年以来，当地人把巴西榥榥木作为一种常用的保健品使用，认为其具有增强性功能、增强体质、抗抑郁、增强抗疲劳等多种功能，根据文献研究，Fabiano[12]等人研究证实，巴西榥榥木与生姜等药物共同作用能够引起增强性功能作用，唐万侠等[13]研究表明巴西榥榥木具有增强神经纤维伸展活性作用，Bucci[14]的研究则表明巴西榥榥木具有增强运动功能的作用。根据用药传统与文献研究，结合网络药理学的分析结果，可从一定程度上验证了网络药理学研究结果的正确性。
第二章 基于代谢组学研究巴西榥榥木对大鼠的代谢机制
网络药理学研究的数据来源于已发表的文献和已建立的数据库，其分析的结果正确与否，取决于文献和数据库的全面性、可靠性和权威性等因素。由于上述文献和数据库多来源于英文文献，而巴西是葡萄牙语国家，因而数据的残缺不可避免。考虑到这些影响因素，本实验又设计了代谢组学实验，以便提供更可靠的药效学研究的方向性提示。
代谢组学是通过对机体代谢产物如血清、尿液、粪便等的分析，找到差异性的代谢物质，并对它们进行综合分析的一种分析方法代谢组学通过研究生物体内所有代谢物质的变化，来探究代谢物与生理病理变化的相对关系[15-16]。运用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF-MS)结合多变量数据分析方法，探究巴西榥榥木对正常大鼠血浆内源性代谢物的影响及其影响机制。本实验拟采用高、低剂量巴西榥榥木，干预正常 SD 大鼠，适时采集血清样本，利用UHPLC-Q-TOF-MS 对给药组和空白对照组大鼠的血清样品进行代谢轮廓分析，结合偏最小二乘法分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)等多元统计分析方法，分析正常大鼠受巴西榥榥木影响，而产生的代谢物的变化及其机理[17]。
基于血清代谢组学，分析榥榥木可能影响的大鼠体内多种代谢通路，为后期进一步研究提供理论依据，阐述巴西榥榥木对机体影响的生物机制。根据其可能影响的代谢通路，进结合网络药理学分析预测的药理作用，为后续药理学实验研究指明方向。
1 材料与仪器
1.1 实验动物
SD 大鼠（Sprague-Dawley Rats），SPF 级，雄性大鼠体重 250g-280g，许可证：fcxk(赣 2018-0003)。
1.2 试剂
甲酸（美国 Sigma-aldrich，色谱级，批号：BCBP4740V）；
乙腈（德国默克公司，色谱级，批号：JAO28730）；
甲醇（德国默克公司，色谱级，批号：1734407415）。
1.3 受试药物
巴西榥榥木：产地为巴西以及亚马逊流域附近，药材由安徽中医药大学彭华胜教授鉴定。
1.4 主要设备与耗材
超高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司，型号：1290）；
四级杆-飞行时间串联质谱仪（美国安捷伦科技有限公司，型号：6538A 型）；
C18 色谱柱（美国，赛默飞世尔科技公司，规格 100×2.1mm，3μm）；
KQ-300VDE 型双频数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
台式高速冷冻离心机（德国艾本德股份公司，型号：5424R）；
氮吹仪（上海比朗仪器有限公司干式氮吹仪 DN-24A）；
Milli-Q 超纯水仪（美国 Millipore 公司）；
4℃冰箱（海尔集团公司，型号：BCD-179K）；
-80℃冰箱（海尔集团公司，型号：DW-86L388A）；
涡旋混合器（上海医科大学仪器厂，型号：VORTEX-5）；
移液枪（规格 10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL，法国吉尔森 Gilson P型）；
样品杯（泰州市强新医疗器械有限公司，批号：20170816）；
离心管（美国，赛默飞世尔科技公司，1.5mL、2mL、15mL，批号：16530837）；
一次性硅胶手套（海门市扬子医疗器械有限公司，批号：20170518）。
2 实验方法
2.1 药物配制
受试药物为巴西榥榥木 70%乙醇提取物的浸膏（5.20g 生药/g），取 1kg 巴西榥榥木干燥根部，放置于 10L 圆底烧瓶中。浸泡 2h 后，用 70%乙醇(8L)以加热冷凝回流法提取 2h，并收集提取液于烧瓶中，再加入 70%乙醇（6L）回流 2h，收集提取液于烧瓶中，再次加入 70%乙醇（4L）回流 2h，回收所有提取液在减压条件下蒸发，制备巴西榥榥木乙醇提取物（6.50g 生药/g）。给药组高剂量 5g（生药）/kg（大鼠）低剂量 2.5g/kg。
2.2 实验动物处理
SD 大鼠 39 只，在室温条件下，大鼠自由饮食与饮水，动物房 12h/12h 昼夜交替的独立环境，适应性饲养 5 天，第 6 天根据大鼠体重随机分 3 组，每组 12只，分别为空白对照组、榥榥木高剂量组 5g/kg 生药量、榥榥木低剂量组 2.5g/kg生药量。
动物给药组给药前称重并编号，每笼饲养 6 只大鼠，夜间自由饮水，但撤回饲料，次日称重给药后再自由饮食，灌胃给药，给药容积为 1mL/100g。每日早上 8：00 固定时间灌胃 1 次，给药天数为 21 天，在第 22 天时处死，期间停止给药并正常供应饮食，对照组保持与给药组相同条件，相同环境，给予相应的蒸馏水。处理动物前大鼠称重记录，根据体重腹腔注射 1mL/kg 的 10%水合氯醛溶液麻醉大鼠。待完全麻醉后：腹主动脉取血，注入 10mL 离心管，注意注入时不得摇动血液，放入 4℃冰箱静置 1-2h，待血清析出后，4℃，3500r/min 离心 15min，吸取血清，离心管分装，存放于-80℃冰箱备用。
2.3 血浆样品处理
将冻存血浆置于室温下解冻，每个样本取 200μl 血清，混合 600μl 的甲醇，涡旋混匀 1min。4℃冰箱中静置 3h，使血清中的蛋白质成分被充分沉淀。常温下15000r/min 离心 10min，取上清液，置于 1.5mlEP 管中，放在浓缩离心干燥机中，使液体成分被挥干，得到的粉末即为上样的样品，上样前密封保存在-80℃冰箱中。
样品的复溶：临上样前，在每个样品中加入 120μl 的 70%的甲醇溶液复溶，涡旋溶解混匀。常温下 15000r/min 离心 15min，取 80μl 上清液，加入到内插管中，置于进样瓶上样。另每个样品均吸取 20μl 上清液混合，作为质量控制样本（QC）上样。
2.4 液相条件
仪器为 waters I 系列 UPLC 系统 ( Waters，USA) 。色谱柱为 Waters ACQUITYUPLC BEH C18 色谱柱 (2.1 mm×50 mm mm，1.7μm )。柱温：40℃。流动相：A：
0.1% 甲酸水，B: 0.1% 甲酸乙腈。流速：0.3ml/min。洗脱梯度：0～2min，1%～1%B，2～9 min，1%～27%B，9～10min，27%～56%B，10～11min，56%～63%B，13～19min，62%～72%B，19～21min，72%～98%B ，21～23min，98%～98%B。进样量1.5ul 。
2.5 质谱条件
电喷雾离子源( ESI)，扫描方式：为正离子模式，离子采集范围 50～1000。
毛细管电压为 3.0 kV，锥孔电压为 40 V，补偿电压为 80V。源温度 120 ℃，锥孔气流速 50 L/h；脱溶剂气温度 400 ℃，流速 800 L/h。使用 MSE 模式采集数据，采集 Contiuum 格式数据，低碰撞能为 4eV，高碰撞能为 20 ～50 eV。为确保质量的准确性和重复性，采用甲酸钠建立质量轴标准曲线，亮氨酸脑啡肽进行实时质量校正。
2.6 数据处理
样品经 UPLC-ESI-QTOF-MS 检测，获取的质谱数据应用 QI2.0 软件进行峰对齐，去卷积以及归一化。以精确分子质量保留时间和归一化后的峰面积建立数据矩阵，数据矩阵导入多变量统计软件 SIMCA-P12.0（Umetrics，Sweden）中进行PLS-DA 和 OPLS-DA 分析，基于 PLS-DA 主成分得分散点图，分析巴西榥榥木对正常大鼠代谢的影响，并应用 OPLS-DA 分析巴西榥榥木影响的内源性代谢标志物。
使用物学数据库，如 HMDB（https://hmdb.ca/）、KEGG（https://www.kegg.ca/）进行代谢标志物的鉴定，并使用 MetPA 对代谢标志物进行代谢通路分析。
2.7 方法稳定性考察
将序列中所有样品各取 10 μL 混合，作为 QC 样品( quality control)。
序列进样前，连续进 3 针 QC 样本，样品检测过程中，每隔 8 个样品进 1 针 QC样本，观察系统的重复性和稳定性。
3 实验结果
3.1 血清总离子流图
采用 UHPLC-QTOF-MS 法分析正常及巴西榥榥木给药大鼠血清代谢物的变化，正模式采集条件下，总粒子流图(TIC)见图 2-1，图中样品峰出峰均匀，相应强度高，且对照组及给药组峰形对应，说明液相和质谱条件适合分析本实验样品。
图 2-1 巴西榥榥木总离子流图
Fig. 2-1Atotal flow of an plasma flow muira puama
3.2 系统及样品稳定分析
样品检测过程中，每隔 8 个样品进 1 针 QC 样本，观察样品检测期间样品及设备的稳定性。本研究以 QC 样品重复性表征样本及设备的稳定，通过重合检测期间 QC 样品的总离子流图（如图 2-2），发现样品检测期间，不同 QC 样品的主要质谱峰的保留时间及相应强度无明显变化，说明样品检测期间，样品及仪器均具有较好稳定性。
图 2-2 样品检测期间稳定性的 QC 图
Fig. 2-2 QC diagram of stability during sample testing
3.3 代谢轮廓的偏最小二乘法判别分析
将匹配后的代谢组学数据导入 SIMCA-P 12.0 软件，构建 PLS-DA 模型，通过实验各组样品在得分散点图观察巴西榥榥木对正常大鼠代谢轮廓的影响。图2-3 中，黑色符号表征正常组，蓝色为低剂量组，红色为高剂量组。图中黑色样本与红色样本无重叠，与蓝色样本几乎没有重叠，且蓝色样本点与黑色样本点之间距离较远。说明红色样本点（高剂量组）与空白组代谢轮廓具有明显差异。进一步删除组内差异样本，并对样本进行PLS-DA 分析，正常与高剂量组样本 PLS-DA得分散点图如图 2-4 ，图中红色样本点与黑色样本点无样本交叉，且组内差异较小，说明高剂量给药对正常大鼠内源性物质代谢具有稳定的影响。低剂量相对高剂量差异更大。
图 2-3 主成分得分散点图
Fig. 2-3 Dispersion of principal components
图 2-4 正常与高剂量组得分散点图
Fig. 2-4 Dispersion of Normal versus high dose groups
3.4 代谢标志物分析
为了分析巴西榥榥木对内源性代谢物的影响，提高多变量统计分析模型的有效性，本研究引入了 OPLS-DA 的数据分析方法，结合变量重要性参数（VIP），组间相关性（P(coor)）初步筛选代谢标志物变量，分析组间变化显著性（T.test），组间变化倍率（Fold Change，FC）筛选巴西榥榥木对正常大鼠内源性物质影响的代谢标志物[18]。本研究过程中变量重要性参数（VIP）设置为大于 1，组间相关性（P(coor)）大于 0.8，初步筛选代谢标志物变量如图 2-5。依据代谢标志物变量的显著性和变化强度（FC>2.0），初步筛选代谢标志变量 49 个，对这 49个代谢标志物进行定性分析。
图 2-5 差异代谢物分析图
Fig.2-5 Differential metabolite analysis figure
3.5 差异代谢物的代谢通路富集分析结果
代谢标志物所分析得到的 m/z 值导入 HMDB 数据库（https://hmdb.ca/）查找对应的差异代谢物，离子模式（Ion mode）选择 Postive,分子量误差小于 0.01对应的 HMDB ID, 即代谢物名称。将 HMDB ID 导入代谢通路富集分析网站（https://www.metaboanalyst.ca/），进行代谢通路分析。
差异代谢物的代谢通路富集分析结果见表 2-1，路径富集分析中的显示所有匹配的路径。如下表所示：β-丙氨酸新陈代谢、丙酸盐新陈代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、类固醇激素的合成等 30 条有意义的代谢通路，其中如图2-6 所示，代谢通路越重要，其所占的比重越大，则显示出的圆圈就越大。
表 2-1 巴西榥榥木影响的代谢通路
Tab. 2-1 Metabolic pathways affected by Muira
图 2-6 巴西榥榥木代谢通路分析结果
Figure 2-6 Analysis of the metabolic pathway of
3.6 代谢通路分析
3.6.1 β-丙氨酸新陈代谢
β-丙氨酸是多种生物试剂和有机合成中间体，β-丙氨酸的代谢主要在大脑和肌肉中， 肝脏中合成的β-丙氨酸，通过牛磺酸转运体(taurinetransporter，TauT)和质子耦合氨基酸转运体 (protoncouplingaminoacidtransporter，PAT)进行转运。研究表明，β-丙氨酸在动物体内主要依靠咪唑二肽发挥作用，咪唑二肽具有缓冲肌肉 pH、抗疲劳、抗氧化、改善记忆功能等生物学作用[19-21]。
3.6.2 丙酸盐代谢
丙酸在体内的代谢，主要是由糖异生完成，丙酸盐可防止霉菌生长，因此常用于食品添加剂（饲料）用于防腐；丙酸根在酸性条件下，形成丙酸，经胃上皮吸收，通过门静脉到达肝脏，进而合成糖原。丙酸转化为葡萄糖经过丙酰 CoA途径、甲基丙二酰和 CoA 途径乳酸途径[22-23]。
3.6.3 类固醇激素的合成
类固醇激素是一类脂溶性激素，又称甾体激素，脊椎动物的肾上腺激素可分为肾类固醇激素上腺皮质激素和性激素两类： (1)肾上腺皮质激素。肾上腺皮质激素由肾上腺髓质分泌产生。目前从肾上腺皮质提取液中分离的类固醇化合物有30 余种，主要为肾上腺皮质激素，其主要的生理功能为调节糖代谢和调节水盐代谢。(2)性激素。性激素属于类固醇类激素，可分为雄性激素和雌性激素。它们主要作用是促进性器官发育，促进性第二性征的发育和维持，以及促进蛋白质合成，使身体肌肉发达。在维持生命、调节性功能，对机体发展、免疫调节、皮肤疾病治疗及生育控制方面有明确的作用。性激素的分泌受脑垂体的促性腺激素调节[24-27]。
4.讨论
代谢组学主要研究的是作为各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物（MW<1000），通过对机体代谢产物的深入研究，可以判断机体的哪些代谢通路受到了影响。结果表明，在巴西榥榥木高剂量给药对正常大鼠内源性物质代谢具有明显的影响，低剂量相对高剂量差异更大。样品峰出液相和质谱条件适合分析本实验样品。通过重合检测期间不同质控 QC 样品的总离子流图无明显变化，说明样品检测期间，样品及仪器均具有较好稳定性。
依据代谢标志物变量的显著性和变化强度，初步筛选出的 49 个代谢标志变量进行定性分析，差异代谢物的代谢通路富集分析得到 30 条有意义的代谢通路，其中主要可以分为四种代谢途径：1.氨基酸类的代谢如：β- 丙氨酸新陈代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解等；2.脂类化合物和脂肪酸类合成与代谢如：丙酮酸代谢、脂肪酸降解、脂肪酸伸长、脂肪酸生物合成、甘油磷脂代谢、醚脂类代谢、脂肪酸盐类代谢等；3.参与能量代谢如：酮体的合成与降解、花生四烯酸代谢、糖酵解和糖合成、柠檬酸循环(三羧酸循环)、乙醛酸和二羧酸代谢等；4.
甾体类化合物的合成如：甾体激素的合成、初级胆汁酸生物合成、类固醇生物合成等。其中多为直接或者间接参与能量代谢，说明巴西榥榥木在血清水平上能够影响大鼠的体内能量的代谢、激素合成、氨基酸代谢等具有一定程度的相关性。
综上，结合网络药理学预测结果，巴西榥榥木的药理作用可能表现在提高运动能力、改善性功能以及改善神经记忆功能方面。
第三章 巴西榥榥木小鼠抗疲劳药理作用研究
巴西榥榥木作为外来物质，虽有道地使用的历史，但是通过可查文献以及国内外的研究未明确指出其是否有毒性和毒性机制，因此，在探究巴西榥榥木的药理作用前，有必要对其进行急性毒性实验，为本部分研究提供理论剂量基础和安全保障。根据网络药理学与代谢组学实验结果，巴西榥榥木的药理作用表现为增强运动能力，增强性功能与改善神经记忆功能等，并结合道地用途其具有舒缓疲劳，提高性欲，抗抑郁等方面的作用，从共性来看，本实验拟在巴西榥榥木安全剂量范围内，以小鼠的负重游泳力竭实验来验证其是否具有增加运动能力和抗疲劳的作用。小鼠负重游泳实验是较经典的抗疲劳实验，通过测定小鼠在水中的负重游泳直至力竭的时间和相关生理指标，可以比较可靠地证实药物的抗疲劳作用[28-30]。
1.材料与仪器
1.1 实验仪器
电子秤(上海光正医疗仪器有限公司）；
Morris 型水迷宫(北京众实迪创科技发展有限责任公司)；
离心机(TG16-WS 湘仪)，酶标仪(BioTek Gen5)；
分析天平(FA1001 上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；
电热恒温水浴锅（HHS 型 上海博迅实业有限公司）台式高速冷冻离心机（德国艾本德股份公司 ，型号：5424R）；
4℃冰箱（海尔集团公司，型号：BCD-179K）；
-80℃冰箱（海尔集团公司，型号：DW-86L388A）；
涡旋混合器（上海医科大学仪器厂，型号：VORTEX-5）；
移液枪（规格 10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL，法国吉尔森 Gilson P型）；
超纯水机（英国 Elga purelab UHQ）；
样品杯（泰州市强新医疗器械有限公司，批号：20170816）；
离心管（美国，赛默飞世尔科技公司，1.5mL、2mL、15mL，批号：16530837）；
一次性硅胶手套（海门市扬子医疗器械有限公司，批号：20170518）；
1.2 实验药材
巴西榥榥木，产地为巴西，由安徽中医药大学彭华胜老师鉴定。受试药物为巴西榥榥木粉末的 70%乙醇提取物（5.20g 生药/g），自制。
1.3 实验试剂
95%乙醇（AR 西陇科学股份有限公司 1710191)；
浓硫酸（AR 西陇科学股份有限公司 190115）；
乳酸（lactic acid）测定试剂盒（比色法）（A019-1-1 南京建成生物工程研究所 20190418）；
尿素氮(BUN)测试盒（脲酶法）（C013-2-1 南京建成生物工程研究所 20190418）；
乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒（微板法）（A020-2-2 南京建成生物工程研究所20190419）；
肝/肌糖原测定试剂盒（比色法）（A043-1-1 南京建成生物工程研究所20190419）；
1.4 实验动物
昆明种 SPF 级小鼠 40 只，雌雄各半，体重 25±2g（购自江西中医药大学实验动物中心许可证号：SCXK(赣)2018-0003），用于急性毒理研究。
昆明种 SPF 级雄性小鼠 80 只，体重 25±2g（购自江西中医药大学实验动物中心许可证号：SCXK(赣)2018-0003），用于抗疲劳实验。
2 实验方法
2.1 巴西榥榥木急性毒性实验
2.1.1 试药制备
取 1kg 巴西榥榥木干燥根部，磨碎成细粉，用布袋包好并放置于 10L 圆底烧瓶中。过夜浸泡 12h 后，用 70%乙醇(6L)以加热冷凝回流法提取 2h，并收集提取液。于烧瓶中再次加入 70%乙醇（6L）回流 2h，收集提取液，最后在减压条件下蒸发，制备巴西榥榥木乙醇提取物（5.20g 生药/kg）。
2.1.2 预实验
取 4 只小鼠，雌雄各半，观察饲养 7d 后进行预实验。实验前禁食不禁水 12h。
按照最大给药剂量 281.84g 生药/kg 灌胃给药。灌胃 1 次，给药容积为 40ml/kg。
参考《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》记录小鼠给药 1h 之内、24h之内以及 7d 后反应，结果发现在此时间区间内小鼠的生命体征良好，无死亡现象，无法测定半数致死量（LD50)，改为测定最大耐受量（MTD）。
2.1.3 正式实验
根据预实验的结果，将 40 只小鼠随机分成给药组和空白组，两组各 20 只，雌雄各半，观察饲养 7 天后进行正式实验，实验前禁食不禁水 12h。给药组按照最大给药剂量 281.84g 生药/kg 灌胃，空白组给予等量的蒸馏水。同上述预实验操作，每组小鼠都灌胃 1 次，给药容积为 40ml/kg，参考《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》记录小鼠给药 1h 之内、24h 之内以及 7d 后小鼠的活动状态、生命体征和死亡情况。
2.1.4 统计学处理
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析，数据以`x±s 表示，各组均数间比较采用 t 检验，P<0.05 为有差异统计学意义。
2.2 巴西榥榥木对小鼠抗疲劳作用研究
2.2.1 动物分组及剂量
将小鼠按体重随机分为 4 组，分别为空白组、巴西榥榥木醇提物高剂量组（14g/kg）、中剂量组(7g/kg)、低剂量组(3.5g/kg)。按小鼠 10mL/kg 体积灌胃给药，空白组给等体积蒸馏水，每天定时 1 次，持续 9 天。灌胃给药期间，小鼠自由取水进食。
2.2.2 动物负重及游泳
在连续给药五天后，对小鼠进行为期三天的适应性负重游泳实验：在小鼠尾根部负荷 8%体重的重物(由回形针和橡皮筋制作)，放置于 Morris 型水迷宫中游泳，水深 30cm，水温 20±2℃，小鼠入水面后开始计时，每次计时 30 分钟。观察小鼠力竭时行为状态，并做好记录，剔除那些不愿意游泳的小鼠。适应性负重游泳实验结束后开始正式实验：小鼠灌胃给药 30min 后，将小鼠同上述操作，放入水中，待至小鼠全部沉于水面下 5 s 后不能浮出水面，且出现第一次所记录的力竭行为时捞出，同时用秒表记录入水至捞出时间作，为小鼠的适应性负重游泳时间。
2.2.3 生理指标检测
负重游泳结束后第二天，对小鼠灌胃给药并于 30min 后进行最后一次无负重游泳，1h 后捞出放置于干燥的地方使其晾干，10min 时立即摘眼球取血，待血液流尽，用脱颈椎法处死小鼠后取肝脏和肌肉。
2.2.3.1 血乳酸测定
将所取血液常温静置 1h，3500r/min 离心 15min，取上层清液，并采用乳酸测试盒进行测定，测定原理为：以 NAD+为氢受体，LDH 催化乳酸脱氢产生丙酮酸，使 NAD+转化为 NADH。其中 PMS 递氢使 NBT 还原成紫色呈色物，该呈色物在 530nm时的吸光度与乳酸含量成线性关系。
2.2.3.2 血清尿素氮测定
将上述所取血清采用尿素氮测试盒进行测定，测定原理为：尿素在脲酶的作用下发生水解，生成 NH4+和 CO2，NH4+在碱性介质中与酚显色剂反应，生成蓝色物质，该物质的生成量与尿素含量成正比，并在 640nm 波长处使用酶标仪测定吸光度。
2.2.2.3 乳酸脱氢酶测定
将上述所取血清采用乳酸脱氢酶测试盒进行测定，测定原理为：碱性条件下，LDH 会催化乳酸形成丙酮酸，丙酮酸与 2,4-二硝基苯肼反应显色，于 450nm 波长处测定吸光度。
2.2.2.4 糖原测定
将所取肝脏和肌肉分别用生理盐水进行漂洗，然后用滤纸吸干多余的水分，准确称量 100mg，与碱液 1:3 加入试管，沸水浴煮 20min，流水冷却；再加入双蒸水稀释制备1%肝糖原检测液和5%肌糖原检测液。其测定原理为：糖原在浓 H2SO4作用下脱水生成糖醛衍生物，衍生物再与蒽酮作用形成蓝色化合物，与同样处理的标准液在 620nm 处比色定量测定。
2.2.4 统计学处理
采用 SPSS19.0 统计软件进行分析，数据以`x±s 表示，各组均数间比较采用 t 检验，P<0.05 为有差异统计学意义。
3 实验结果
3.1 巴西榥榥木醇提物急性毒性实验结果
巴西榥榥木醇提物毒性实验结果如表 3-1，其中差异性 P>0.05，说明巴西榥榥木醇提物组与空白组 7d 内体重的变化无明显差异。受试药物巴西榥榥木醇提物按 281.84g 生药/kg 剂量给小鼠灌胃后，观察 7d，无动物死亡，活动未明显改变，安静、无明显烦躁，未出现其他不良反应，未出现明显的毒性反应。因此巴西榥榥木醇提物在 281.84g 生药/kg 剂量下无毒。
表 3-1 巴西榥榥木醇提物最大给药量测定
Tab. 3-1 Measurement of the maximum dose of the extract muira puama
3.2 巴西榥榥木醇提物对小鼠适应性负重游泳时间影响
巴西榥榥木醇提物对小鼠负重游泳时间如表 3-2，结果显示，巴西榥榥木醇提物中剂量组和低剂量组在适应性负重游泳实验中游泳时间显著大于空白组，而高剂量组与空白组相比无显著差异。由此可知巴西榥榥木中剂量组和低剂量组对小鼠适应性负重游泳时间有显著的延长作用。
表 3-2 小鼠适应性负重游泳实验时间
Tab. 3-2 Experimental time of adaptive weight-bearing swimming in mice
注：表示与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01.
3.3 巴西榥榥木醇提物对运动后小鼠生理指标影响
巴西榥榥木醇提物对运动后大鼠生理指标检测结果如表 3-3 和表 3-4，结果显示，巴西榥榥木醇提物中剂量组和低剂量组乳酸含量与空白组比较具有统计学意义（P<0.01）、乳酸脱氢酶活性的增加差异具有统计学意义（P<0.01 和 P<0.05），肝糖原和肌糖原含量的增加差异无统计学意义（P>0.05），中剂量组血清尿素氮含量的减少差异具有统计学意义（P<0.01）。这表明巴西榥榥木醇提物中剂量组和低剂量组能显著减少运动后小鼠乳酸含量、增加乳酸脱氢酶的活性，且中剂量组血清尿素氮含量也显著减少。
表 3-3 运动后小鼠生理指标检测结果 1
Tab.3-3 Test results 1 of physiological indexes of mice after exercise
注：表示与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01.
表 3-4 运动后小鼠生理指标检测结果 2
Tab.3-4 Test results 2 of physiological indexes of mice after exercise
注：表示与空白组比较，*P<0.05，**P<0.014 讨论
本实验在探究巴西榥榥木醇提物对小鼠抗疲劳作用中，采用了适应性负重游泳来构建疲劳模型.负重游泳是目前抗疲劳药物研究中最常用的疲劳模型，且游泳时间是判断抗疲劳效果最直观、最常选择的判断指标。乳酸（lactic acid，LA）是机体供能系统的重要氧化基质，通过运动，机体血液及肌肉组织中乳酸含量会增加，而乳酸过多则会破坏机体酸碱平衡、引发负面效应，从而导致疲劳的产生[31]。为了维持内环境的稳定，机体必须消除过量的乳酸，目前主要通过以下两种方式：1、心肌、骨骼肌或其他组织细胞利用充足的氧气条件，在乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)的作用下，将乳酸转变成丙酮酸，随后进入线粒体被直接氧化分解成 CO2和 H2O[32]。由此可说明乳酸脱氢酶含量越高，乳酸消耗越多，疲劳程度越低；2、机体在运动时的血乳酸浓度会升高，然后激活肝脏和骨骼肌细胞中的糖异生途径，从而将乳酸转化为葡萄糖和糖原。糖原（glycogen，Gly）包括肌糖原和肝糖原，在长时间耐力运动过程中，为了延缓中枢和外周疲劳，糖原会大量分解，因此糖原储备反映了机体疲劳程度，机体越疲劳糖原消耗越多，蛋白质分解代谢加速，血清尿素氮含量增高。血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)是机体运动后的代谢产物， 在体内大量堆积会刺激机体组织和神经系统并产生疲劳感，含量越高疲劳感越强，是反映机体疲劳程度的重要指标[33]。本实验在适应性负重游泳实验的基础上，检测了小鼠这几项生理指标，能够更加全面、客观地评价巴西榥榥木醇提物对小鼠的抗疲劳作用。
在小鼠负重游泳实验过程中，疲劳模型的构建存在不稳定性，经分析主要有以下两方面因素：客观因素和主观因素。客观因素包括室温、水温、动物个体差异、体重变化、水中动物相互影响（互相踩踏、拥挤）等；主观因素是指实验者自身造成的影响，如实验数据是人为测定，可能存在细微的时间偏差。小鼠属于恒温动物，如果室温或是水温变化过大，小鼠很难适应这些变化就会导致游泳时间过长或过短，甚至影响小鼠的生理机能和实验反应性。另外，实验动物自身差异性较大，所以尽管在实验中尽量将这些影响降到最低，但不稳定性始终无法避免。
本实验结果表明：巴西榥榥木醇提物在 281.84g 生药/kg 剂量下是基本没有毒性的，巴西榥榥木醇提物中剂量组和低剂量组能明显延长小鼠负重游泳时间，增强小鼠耐力；通过试剂盒检测及数据分析结果显示，与空白组比较，巴西榥榥木中剂量组和低剂量组乳酸含量显著减少、乳酸脱氢酶活性显著增加，肝糖原和肌糖原含量的增加无明显差别，中剂量组血清尿素氮含量显著减少。这说明巴西榥榥木在舒缓疲劳、提高机体耐力、抗疲劳作用方面具有明显的效果，也为后期巴西榥榥木应用于抗疲劳药物的研究提供实验依据。
结 论
根据网络药理学对成分-靶点-疾病分析结果预测，巴西榥榥木可能对于消化系统疾病、肿瘤、骨骼肌疾病、肝硬化、呼吸道疾病等有一定的治疗作用。由于数据来源的有限性，网络药理学对于巴西榥榥木药理作用预测可能存在一定的偏差。
通过差异代谢物的代谢通路富集分析得到四种代谢途径，其中直接或者间接参与体内能量代谢为主要有柠檬酸循环、脂肪酸降解、酮体的合成与降解、雄性激素的同化作用等，均提示其具有增强机体能量代谢的作用。由于数据来源于动物实验，结论比网络药理的数据可靠性更高。
巴西榥榥木的毒性实验结果表明，巴西榥榥木醇提物安全无毒。药效学验证性实验表明，网络药理学和代谢组学数据分析，对药效学具有一定的提示作用。
抗疲劳可作为巴西榥榥木今后研究的重点方向之一。
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致 谢
首先，感谢我的导师×××教授，他在生活上给予我亲切关怀，在学习上鼓励我参加学术会议开阔眼界，在科研上给予我细心的指导和不懈的支持。在此谨向×老师致以最崇高的敬意和最诚挚的感谢！
我还要感谢A××老师以及B××老师在试验中给予我的帮助，让我能够完成本课题。感谢药理学科组所带来的一切科研条件，促进了我的成长和提升。
感谢师兄师姐对我的指导，感谢同门、同学和师弟师妹在实验过程中对我无私的帮助和支持。
针对巴西榥榥木这种研究信息较少的天然药材，本研究拟通过网络药理学、代谢组学和药理学实验相结合的方式，建立一种筛选其药效的实验模式。...