清香型白酒大曲研究进展

　　摘要：酒曲在白酒酿酒过程中有重要影响，酒体风味主要与酒曲微生物发酵代谢产物有关，关注大曲中微生物有助于改善大曲酶系统，进而丰富白酒风味。综述了清香型白酒及大曲工艺、质量检测指标研究进展及微生物群落组成，旨在提高清香型白酒大曲质量，并为改善清香型白酒风味提供一定理论基础。

　　关键词：清香型白酒;清香型白酒大曲;微生物群落结构;酒曲质量检测;

　　Abstract：Yeast plays an important role in the brewing process, and the liquor body flavor is mainly related to microbial fermentation metabolites of yeast. Paying attention to microorganisms in daqu can improve the enzyme system of daqu and enrich the liquor flavor of clear flavor. In order to improve the quality of pure flavor liquor and Daqu and p rovide a theoretical basis for improving the flavor of pure flavor liquor, this paper reviewed the research progress of technology, quality detection indexes and microbial community composition of pure flavor liquor and Daqu.

　　Keyword：clear flavor liquor; Clear flavor liquor Daqu; Microbial community structure; Quality inspection of koji;

　　白酒作为中国古老且具有特色的酒类之一而闻名于世界，以粮食谷物为原料，以大曲、小曲或麸曲及酒母等为糖化发酵剂，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏而制成的蒸馏酒。我国白酒主要分为浓香型、清香型、米香型与酱香型，除了以上四种香型还有芝麻香型、凤香型、兼香型等多种衍生香型白酒，随着白酒发酵工艺进一步发展，越来越多具有特殊工艺，别具一格风味的白酒将投入市场，呈现百花齐放的场面。

　　清香型白酒，又称为汾香型白酒，代表酒为山西汾酒，其又分为大曲清香型白酒与小曲清香型白酒。采用清蒸清糟酿造工艺、固态地缸发酵、清蒸流酒，强调“清蒸排杂，清洁卫生”，因而有口感清香纯正，余味爽净等特殊酒香。有言：“若作酒醴，尔惟曲蘖”，在曲与酒的关系中，曲占先导关系，曲好酒才能好。我国酿酒酒曲种类繁多，大致可分为五类：大曲、小曲、红曲、麦曲、麸曲。所谓大曲是以大小麦为原料，经粉碎加水压块而成的[1]，形状大多像砖块的形状且有丰富的微生物和酶类物质，在发酵过程中产生多种代谢产物，为白酒增香增味，提供菌源进行糖化发酵，并有投粮和生香作用。

　　大曲是以小麦为主要原料，添加不同辅料，按照制曲温度不同可分为高温大曲、中高温大曲、低温大曲；按照生产作用不同可分为酱香型大曲、浓香型大曲、清香型大曲及兼香型大曲[2]。清香型白酒大曲是以大麦与豌豆为主要原料，顶温控制在50℃以下，相较其他大曲制曲温度低。

　　1 清香型白酒相关工艺

　　1.1 清香型白酒工艺

　　清香型白酒的工艺特点是高温润糁，低温发酵，“一清到底”，运用固态地缸发酵，因其独特工艺，清香型白酒也拥有了清香醇正，绵甜爽净，酒体协调的独特风味[3]。

　　其工艺流程如图1所示。

图1 清香型白酒工艺流程图

　　1.2 清香型白酒大曲生产工艺

　　清香型白酒大曲制曲温度不超过50℃，制曲时着重于曲的排列且控温严格，热凉升降幅度较大，小热大凉，适合于多数中温性微生物生长。出房的清香型白酒大曲通常由品温不同分为清茬曲、红心曲和后火曲三种。

　　其工艺流程如图2所示：

图2 清香型白酒大曲生产工艺流程图

　　2 清香型白酒大曲质量检测研究现状

　　目前新版大曲质量检测标准相对于旧版更完善、更科学，旧版检测标准中液化力、发酵力等借鉴了纯种酵母和单一酶制剂的检测标准概念，针对大曲检测明显不合适，大曲是“多酶多菌”的系统[4]。根据明红梅[5]等人对大曲传统质量评判指标与新指标进行对比分析，传统检测指标体系主要包括感官与理化指标两部分，其中感官指标占较大比例达60%，新质量检测体系新增了生化性能指标，指酒化力、生香力和酯化力，并将感官指标降低至10%，相比之下生化理化指标更能决定大曲质量的好坏。

　　2.1 清香型白酒大曲感官分析研究现状

　　感官分析较为传统，主要从外观、断面、香味、皮张厚度四个方面进行评分分析，其中皮张厚度则是影响大曲质量的重要因素，张振科[6]等人通过对比不同曲皮厚度的大曲的理化指标和感官评分等，得出曲皮厚度在0.5～0.8 cm之间的大曲质量较优。随着技术发展进步，除了选用专业技术人员做感官评价外，针对大曲香味一项还采用电子鼻进行系统的识别分析，结果较传统人工更为客观。张馫[7]等人针对大曲复杂的香气成分难以具体归类这一问题，选择敏感传感器，进行一系列正交优化实验，最后比对验证各平行样本数据之间的极差明显降低。刘延波[8]等人通过对比优质曲与劣质曲的感官特征及其理化性质、微生物指标，证明两种曲存在显着差异，且优质曲可以做良好的糖化发酵剂。

　　2.2 清香型白酒大曲生化指标测定研究现状

　　在清香型大曲生化理化指标测定中，生化指标有酒化力、酯化力、生香力。大曲酒化力是衡量大曲产酒能力高低的重要指标，杜礼泉[9]等人通过对酒化力检测方法进行改进，用大曲生成乙醇的能力来判断大曲产酒能力的强弱，最后与酯化力、液化力、糖化力做对比，证明改进后的酒化力检测方法可以代表大曲产酒能力的大小。袁志强[10]等人针对大曲在贮藏期酒化力的变化趋势进行了分析发现大曲贮存一年后酒化力等指标开始下降，两年后下降明显。

　　大曲酯化力是指大曲醇与有机酸发酵生成酯的能力大小。针对大曲酯化力对固态酒糟发酵的影响，王小琴[11]等人通过控制是否添加曲粉来对比发酵完成后酒糟中己酸乙酯的含量，从而证明大曲酯化力对发酵生成己酸乙酯有重要作用。汤有宏[12]等人研究了加曲量、酯化时间、酯化温度及添加己酸对酯化力的影响，建立了正交优化实验分析得出发挥大曲酯化力的最优条件。除了对大曲本身酯化力进行分析研究之外，在其发酵过程中，大曲中酯化酶产生菌数量及其酯化能力的强弱也直接影响整体酯化力，宫若楠[13]等人从衡水老白干酒中筛选分离出一株高酯化力的毛霉菌株，可达263.55 mg/g麸曲（以乙酸乙酯计）。滕巍[14]等人针对提高浓香白酒中己酸乙酯的含量，在大曲中筛选到一株高产己酸乙酯酯化酶的黑曲霉，并对其培养条件进行优化，得到最适培养基，其615.8 mg/d L。

　　大曲生香力是反映大曲复合曲香物质生成的强弱的能力大小，其可以由大曲本身淀粉消耗量、蛋白质降解量、脂肪转化量来体现，但由于目前转化的脂肪酸还没有合适的方法进行检测，所以目前仅从淀粉消耗量及蛋白质降解量来衡量大曲生香力强弱[15]。

　　2.3 清香型白酒大曲理化指标测定研究现状

　　大曲理化指标包括传统指标中水分、酸度、淀粉等基本指标，还包括糖化力、液化力、发酵力等。其测定方法一般参照行业标准QB/T 4257-2011《酿酒大曲通用分析方法》。

　　大曲水分含量、酸度与淀粉含量是衡量大曲质量优劣的重要标准，传统检测方法是将大曲多次烘干至恒重，此法准确简单但是耗时长。针对该问题，目前研究一般都利用近红外光谱法建立数学模型，进行更快捷准确的测定，更能及时指导生产，具有更强的实用性。胡心行[16]等人运用近红外光谱技术和最小二乘法结合，建立了一种可以快速检测大曲水分的新模型，最后验证表明该方法可以有效准确的检测大曲水分含量。测定大曲酸度与淀粉含量一般采用酸碱滴定法和水解法，存在操作繁琐且不确定因素多等缺点，苏鹏飞[17]等人考虑到水分、酸度、淀粉都在近红外光区获得响应，因此他们结合偏最小二乘法分别建立了大曲水分、酸度和淀粉的检测模型，各方面模型线性关系良好。除了近红外光谱法，王开铸[18]等人利用采集的大曲温度、水分、酸度数据建立了相关性预测模型，最后结果显示支持向量回归机建立了良好的酸度预测模型。大曲酸度检测一般为中和法。

　　清香型白酒大曲由于工艺原料中淀粉含量多，其中淀粉水解酶对大曲质量影响较大，关系到淀粉转化率及后续出酒率，研究证明，乳酸-乳酸钠缓冲液更接近发酵中的p H环境，因而也更有利于淀粉水解酶作用。张秀红[19]等人对大曲中涉及到的各类淀粉水解酶，在分子基因角度分析其酶学特征，为大曲微生物代谢途径分析发展奠定了基因组基础。

　　大曲是产酒的生香剂、糖化剂和发酵剂，其对大曲发酵后酒的质量至关重要，任道群[20]等人在对泸型大曲发酵过程的研究中发现，曲块刚入房时糖化力较高，随着温度升高，糖化力下降较快，在培曲初期液化力几乎为零，随着发酵过程中微生物数量的升高，液化力也随之升高，因此在发酵过程中严格控制温度才能保证发酵质量的稳定。传统检测大曲糖化力的方法是斐林试剂滴定，但此方法不确定因素很多，易造成误差且重复性差，针对该问题，曹润洁[21]等人利用DNS试剂与还原糖作用显色，测量OD值来检测大曲糖化力，更准确便捷。

　　2.4 清香型白酒大曲酶系指标研究现状

　　大曲蛋白酶在大曲发酵过程中起到分解蛋白质、生成氨基酸、提高原酒质量、协同各类微生物共同发酵代谢等作用。目前研究多数从微生物层面进行分析研究，筛选高产蛋白酶的菌种，酿酒过程中主要产酸性蛋白酶的是霉菌和少量细菌，对其进行深度研究，扩大菌种库有利于后续有效指导加曲酿酒，蛋白酶活性检测一般采用福林酚试剂法。冯利芳[22]等人从前清香大曲中筛选了一株高产中性蛋白酶的菌株，经鉴定为芽孢杆菌属，通过优化该菌株产酶条件，使其产酸性蛋白酶提高了7.65倍,中性蛋白酶提高了101.5%。魏丕伟[23]等人在中高温大曲中用酪蛋白透明圈法筛选分离出6株蛋白酶的霉菌，可用于后续多种产蛋白酶菌种复配应用大曲发酵；鲁珍[24]等人从高温大曲中筛选出一株高产中性蛋白酶的菌株，通过单因素和正交试验得到该菌株的最适产酶条件，经鉴定其为一株解淀粉芽孢杆菌，将强化后的菌株应用于大曲中，可提高产酒稳定性。

　　因而大曲蛋白酶能力对大曲发酵产酒具有较大影响，向双全[25]等人对影响固态酿酒出酒率的关键因子进行响应面分析，得到出酒率最佳的方案，同时得出糟醅酸度与蛋白酶活力的交互作用强，说明其有较强关联性。

　　3 清香型白酒大曲微生物

　　清香型白酒大曲在酿造过程中不仅是糖化发酵剂，也是生香剂，据周晨曦[26]等人统计，已经检测到大曲中有456种风味物质，其中酯类最多可达94种，其次为醇类、醛类及酸类等，其中250种只通过内标法等进行了定量分析。在清香型大曲白酒中微生物也各司其职，霉菌是酿酒的糖化动力，酵母菌是酿酒的发酵动力，细菌则是酿酒中的生香动力[27]。

　　3.1 微生物主要来源

　　清香型白酒大曲中微生物类群主要是霉菌，其次是细菌和酵母，菌种主要来源有三点：(1)主要依靠制曲原料中的自然微生物及用水中的微生物，聂凌鸿[28]等人通过跟踪单粮型大曲制作流程，微生物在初入房时达到高峰期，此时处于培养初期的各条件适合微生物生长，到达中期微生物的数量出现低谷期后又有所回升，说明大曲中微生物通过自身协调抑制来达到平衡，温度是影响微生物数量变化的主要因素，在实际生产中控制曲温是制曲的关键控制点；(2)有时在制曲过程中添加曲母，达到改善曲块中微生物菌群的作用，曹苗文[29]等人在大曲中添加3%的高酯曲，跟踪测试后续酒的理化指标，总酯提高了2.35 g/L，乙酸乙酯提高了1167.07 mg/L，乳酸乙酯提高了669.81 mg/L。(3)外界环境附着或混入大曲后的发酵培养，一般的制曲过程都是在开放的曲房中进行，不会进行无菌操作，所采用的工具器皿也不会专门进行灭菌操作，曲坯上生长出来的菌类一部分就是由地面及工具上接触而感染上的，也有一部分菌丝在空气中进行传播。

　　3.2 霉菌

　　霉菌在清香型白酒大曲的酯化力、糖化力方面起着重要作用，主要有毛霉、曲霉、根霉等，霉菌代谢产物不同，发挥的作用也不同，如米曲霉是清香型大曲中主要的根霉，其和黑曲霉都是糖化菌种，可将淀粉转化为可发酵性糖，张翠翠[30]等人通过将黑曲霉与米曲霉进行复配接种于酒曲上，最后测得液化酶酶活和糖化酶酶活均有显着提高。不同霉菌代谢产物也不同，例如米根霉产乳酸，黑根霉产延胡索酸和琥珀酸。王佳丽[31]等人在汾酒大曲中分离到红曲霉，经检测其有很强的液化力、糖化力和蛋白酶活性。马凯[32]等人对汾酒大曲进行了r DNA序列的分子生物鉴定，证明了伞枝梨头霉和匍枝根霉是汾酒大曲中的优势霉菌菌种。朱莉莉[33]等人从大曲、小曲、麸曲中筛选出了一株M23产香霉菌，其总酯含量达1.765 g/L，并证明复配可以提高酒曲质量。

　　3.3 细菌

　　清香型白酒大曲中的细菌多为杆状细菌，分为芽孢和非芽孢杆菌。乳酸菌的含量是衡量大曲质量好坏的重要指标，乳酸含量的多少也是直接决定酒品质好坏的重要指标，少量可使酒香味协调具有独特香气，过量则使酒变酸，出现涩味。孙超[34]等人对白酒大曲中的乳酸菌进行代谢产物、代谢途径分析，其可以促进美拉德反应，生成香味物质的同时形成酸性环境，抑制其他杂菌生长繁殖，其代谢的一些抑菌物质也可改善微生物环境。王进明[35]等人认为清香型白酒生产中常见乳酸乙酯偏高的问题与大曲培养过程温度与酒醅质量有关，降低乳酸乙酯含量可以从控制大曲质量入手，提高大曲本身糖化力、液化力等，确保乳酸菌处于相对被抑制的状态，同时注意成曲贮藏的环境与温度等条件，多使用陈曲。在酿造过程中乳酸菌与其他菌的相互作用也被人们重视起来，Qing-Song Zhao[36]等人在近期多篇研究中发现乳酸菌在发酵过程中可与其他一些细菌真菌共同作用，减少一些如氨基甲酸乙酯，对甲酚等有害物质的生成。熊君燕[37]等人在模拟清香型白酒发酵环境，建立了一种固态培养方法，证明MJ14在与乳酸菌共同培养中可以抑制乳酸菌产乳酸，但只适用于部分乳酸菌和酵母菌。

　　清香型白酒大曲中芽孢杆菌最多，具有分解蛋白质和水解淀粉的能力，同时也可生成酒体中芳香类物质如双乙酰等，马美荣[38]等人于清香型白酒中筛选分离出一株高产四甲基吡嗪的枯草芽孢杆菌，并将其作为一株功能菌应用于原酒的酿造，大大提高了原酒中的四甲基吡嗪的含量，使酒体风味更醇厚，提升了酒的品质。

　　3.4 酵母菌

　　清香型大曲中的酵母一般有酒精酵母、假丝酵母、毕赤酵母等，其在白酒生产中起发酵、产酯、生香的作用，程伟[39]等人在清香型白酒酒醅中筛选出一株高产乙酸乙酯的酵母菌，检测证明其有较高的发酵力和酯化力，在白酒酿造方面有良好前景。针对酵母菌分离中易受霉菌等丝状真菌的干扰而无法计数这一问题，关凯乐[40]等人验证了在YPD培养基中添加3.3 m L/L的乙酸可以有效限制霉菌生长的同时对酵母菌的生长没有明显抑制作用，对后续清香型白酒相关微生物研究具有指导意义。

　　产酯酵母是目前酿酒微生物界致力于发掘的要点，产酯酵母可以在发酵过程中通过酶作用将糖、醇等转化为醛、酯等芳香物质，王旭亮[41]等人采用变色圈平板和发酵力筛选两株高产乙酸乙酯和乙酸的酵母菌，经鉴定为异常毕赤酵母。

　　3.5 清香型白酒大曲微生物研究方法

　　随着现代生物技术的进步，对于微生物的研究也不再拘泥于传统的培养分离纯化、菌种鉴定，也有应用PCR-DGGE技术来对微生物进行分析研究，适用于白酒复杂体系，基质干扰大，同时也适用于分析一些含量低，难培养的微生物如乳酸菌，王海燕[42]利用PCR-DGGE、q PCR、HS-SPME-GC-MS技术分析汾酒发酵酒醅随发酵时间的微生物变化趋势，确定了产酯酵母对白酒风味贡献最大，起着调节窖池环境，影响其他微生物生长代谢。姚淑敏[43]等人利用PCR-DGGE法对不同酒曲中细菌多样性进行分析研究，从6种酒曲中分离出12属细菌，同时也证明了魏斯氏菌是酒曲中最常见的细菌。H.-Y.Wang[44]等人利用PCR-DGGE技术对不同产地、不同生产工艺生产的大曲中微生物群进行鉴定和比较，在获得了大曲中常见的细菌、真菌和酵母菌以外还证明了生产温度对大曲微生物组成的影响大于地理区域。

　　近年来高通量测序技术（HTS）作为新一代测序方法可以一次性对几百万到十几亿的DNA分子进行分析和测序，可以对许多复杂菌种样品进行深度测序，其通量高、成本低、准确率高。雷振河[45]应用高通量测序技术对清香型白酒酿造用的大曲和酒醅进行分析，大曲中的优势原核微生物有厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、酸杆菌门，优势真核微生物有曲霉菌属、热子囊菌属、根霉菌属、嗜热真菌属、假丝酵母。黎江华[46]等人利用高通量测序技术对五倍子酒曲和酒醅进行微生物分析测序，检测出其主要优势微生物是魏斯氏菌属和丝孢酵母属。周森[47]等人将传统分离分析方法与高通量测序技术结合，得出真菌数量远多于细菌数量，不同大曲样品微生物总数差距较大。而张双燕[48]等人采用高通量测序技术对北京某清香型酒厂大曲细菌和真菌进行微生物多样性分析，全面系统的分析了清香型酒曲微生物在门、纲、目、科、属、种不同分类水平上的相对丰度，相对于其他研究更为全面。

　　4 清香型白酒大曲制曲存在问题及展望

　　清香型大曲酒在酿造过程中酒曲的质量直接影响到酒的质量好坏，正是由于酒曲中多种多样的微生物的共同代谢作用使得酒的风味各有不同，曲房的地理环境、温度、气候等都会影响曲中微生物的繁殖代谢增长，且在制曲过程中需要严格控制开窗开门的时间，并根据季节天气来进行相关调整，保证采用的曲符合QB/T 4257-2011中的感官包括断面、香味、皮张等的要求与相应理化指标，将合格的曲投入生产，才能保证基酒的质量。

　　4.1 关于清香型白酒大曲存在以下问题：

　　(1)制曲机械化程度低。制曲分为机械制曲与人工制曲，研究表明机械化制曲与传统人工制曲在曲块储水率及淀粉含量等方面存在较大差异，目前大部分工厂仍采用人工制曲，存在产品质量难以保持一致，且成本较高等问题，因此曲房与制曲过程优化还有较大发展空间；(2)曲块活力不稳定。因为与使用小曲酿酒相比更注重大曲中微生物所产生的酶制剂与呈香物质的作用，因此大曲酿酒时加曲量大，达到15%～30%，从而增加成本；(3)发酵方式单一。使用大曲酿酒虽然口感好但是只适用于固态发酵，其他方式不适用，固态发酵需要劳动力较多，且发酵时间长，出酒率也较低；(4)目前对于清香型白酒大曲的研究多为定性研究，定量研究较少，且与市售酒曲质量参差不齐，没有统一国际标准来规范。

　　4.2 针对以上问题提出下面几点展望：

　　(1)推进智能曲房的建设。最大程度实现机械化制曲，通过智能检测达到精准控温控湿，代替人工可有效控制品质，且机械制曲曲块整齐划一，表面光滑且质量稳定，降低人工成本，产量大等，且符合现代绿色生产的大趋势；(2)致力于强化大曲的研究。为缓解工厂用曲压力，可以大曲为曲种制备多微强化曲，将自然环境中分离出的功能微生物接种于传统大曲上，提高大曲发酵、糖化或生香功能。(3)发展半固态发酵工艺。半固态发酵生产效率高，耗粮少，产量高，成本低；(4)推进酒曲质量标准统一化。成立“全国制曲协会”从而起草大曲统一标准也成为酿酒行业发展的必然趋势。

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