脂肪酶基因工程菌株的构建及产酶情况调查

　　脂肪酶（ EC3. 1. 1. 3） 又称为三酰基甘油酯水解酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外，还表现出如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶和酰肽水解酶活性等（ Tong 等，2007） .

　　脂肪酶催化反应具有立体选择性、底物专一性、副反应少、反应条件温和、不需辅酶及可用于有机溶剂等特点，在食品、皮革、生物柴油、医疗医药和洗涤剂等多个生产领域都有应用，如用于合成食品调味料，作为添加剂应用于洗涤剂中，手性药物拆分和精细化学产品的合成等 （ Giberto 等，2013） .动物、植物和微生物中许多种都可产脂肪酶，微生物种类繁多，易于培养，可通过育种手段提高产酶量，且有比动植物脂肪酶更广的作用温度、作用 pH 和底物特异性，因而，从微生物代谢产物中寻求脂肪酶成为科研工作者的研究热点（ 周换景等，2013） .

　　对微生物发酵产脂肪酶菌株的筛选、发酵条件的优化、酶的分离纯化和酶学性质进行综述，并且对脂肪酶基因工程菌株的构建及产酶情况进行调查，为脂肪酶的研发及应用提供理论依据。

　　1 产脂肪酶菌株的筛选及发酵

　　脂肪酶产生菌在自然界中分布广泛，从土壤、海洋和冰川中皆分离到了产脂肪酶的菌株，而且在一些极端环境下还分离到具有特殊性质的脂肪酶，进一步拓宽了脂肪酶的应用领域。

　　大多数微生物来源的脂肪酶是诱导酶，添加诱导物可以有效提高酶活力，脂肪酶作用底物及可以增强细胞膜通透性的变性剂常被用作脂肪酶诱导物。Long 等（ 2007） 对黏质沙雷菌脂肪酶发酵培养基进行优化，并对诱导物进行研究，结果表明： 以糊精和牛肉膏结合硫酸铵作为碳源和氮源，随着培养基中 Tween -80 从 0 增加到 10 g/L,脂肪酶产量从 250 U/L 提高至 3 340 U/L,充分说明诱导物在脂肪酶生产中的重要作用。

　　微生物营养谱宽泛，很多工业或农业废渣都可以作为微生物生长代谢的良好基质。Coradi 等（ 2013） 比较了农业和工业废渣液体或固体发酵哈茨木霉产脂肪酶的生产，发现无论液体发酵还是固体发酵，培养基中添加 1% （ 体积/体积） 的橄榄油都可以有效提供产酶量。Salgado 等（ 2014） 利用橄榄油厂和酒厂的残留物作为培养基质固态发酵曲霉生产脂肪酶，发现尿素是影响脂肪酶产量的关键因子。Tween -80 和尿素都为变性剂，可以增大细胞膜的通透性，从而使脂肪酶能够快速分泌出细胞。Venkatesagowda 等（ 2015） 以提取椰子油后的糟粕为原料固体发酵 Lasiodiplodia theobromae VBE - 1,发现一定量的矿物盐和椰子油均可以增强脂肪酶活性。Fleuri 等（ 2014） 研究发现以 75%麦麸和 25%甘蔗渣为培养基，含水量40%时脂肪酶产量为10.82 U/g.

　　除了利用微生物发酵工农业废渣产脂肪酶外，还有利用微生物发酵橄榄油厂工业废水生产脂肪酶的报道，但是需要对废水进行稀释，同时添加矿物盐可以有效提高产酶量，该步骤处理还可降低废水 COD值，减少酚类和芳族化合物 Luís 等（ 2013） .表 1 综合比较了国内外研究人员利用不同微生物发酵产脂肪酶的产酶条件和产酶活力。

　　2 微生物来源脂肪酶的分离纯化

　　酶的分离纯化是对酶学性质研究的基础，脂肪酶作为一种具有生物催化活性的蛋白质大分子，在分离时既要考虑纯化倍数，还要考虑活性回收率及比活力。微生物发酵液成分复杂，其中既含有代谢产物，还有未发酵完全的底物及生长的菌体，因此，从中提取脂肪酶有一定的难度。目前已有一些脂肪酶被分离纯化，具体见表 2.

　　由于微生物发酵液体积较大，酶质量浓度低，因此对粗酶液进行浓缩是必要的，有机溶剂沉淀和盐析是常用的浓缩手段。有机溶剂沉淀易造成酶活性的下降或失活，利用有机溶剂对绿脓杆菌 CS - 2脂肪酶进行沉淀分离，酶活性回收率 64. 7%,酶活力损失近 40% （ Ren 等，2010） .硫酸铵盐析是对酶进行初步分离常用的手段，不易造成酶活力的损失，在一定程度上还有保护酶活力的作用，但是要注意向酶液中溶解硫酸铵时要边加入边缓慢搅拌，不宜快速搅拌，否则湍流会导致局部酶活力不可逆丧失，此步骤正确的操作方式对于酶的纯化尤为重要。

　　层析法是对脂肪酶精细分离的有效手段，文献报道中多采用的是离子交换层析和凝胶过滤层析。

　　离子交换层析依据样品中各个组分带电荷性质的不同将其一一分离，在离子交换层析过程中，为了便于洗脱吸附到层析介质上的组分，流动相的离子强度或 pH 变化会较大，有可能会造成那些对 pH 变化敏感的酶的失活； 凝胶过滤层析依据样品中各个组分分子大小的不同将其一一分离，用于分级分离往往通量低，流速慢，这样就导致纯化效率降低。

　　从文献报道看，多数活性回收率较低，可能也是因为以上原因。

　　3 通过基因工程手段提高脂肪酶产量

　　对脂肪酶基因进行突变或重组，从基因角度提高酶活性或稳定性是现在一个新的研究热点。吴厚军等（ 2013） 人对来源于 Rhizopus chinensis CCTCCM201021 的脂肪酶进行了 D190V 定点突变，通过巴斯德毕赤酵母表达突变酶 D190V,使该酶的最适温度和热稳定性得以提高。王建荣等（ 2014） 人采用同源克隆法获得雪白根霉的脂肪酶基因（ rnl） ,在毕赤酵母 X -33 中成功表达，重组酶活可达48 U/mL,重组酶最适 pH 8. 5,最适反应温度 35 ℃。苏二正等（ 2014） 人将短小芽孢杆菌脂肪酶基因在大肠杆菌中进行表达，酶活达到 2 000 U/mL,并对重组酶性质进行研究。Fang 等（ 2014） 研究了细毛嗜热霉脂肪酶（ TLL） 基因在巴斯德毕赤酵母 GS115 菌株中的表达，以 1. 2%甲醇作为诱导物，pH 7. 0,27 ℃培养144 h,酶活 1 960 U / mL.韩双艳等（ 2013） 研究了抗辐射不动杆菌碱性脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达，摇瓶发酵液上清酶活由野生酶 3 ~4 U/mL 提高至重组酶 65 U/mL.

　　4 展望

　　综上所述，微生物脂肪酶的研究主要围绕菌种筛选、发酵条件优化及酶的初步分离纯化展开。产酶菌种主要有黑曲霉、根霉、假丝酵母和假单胞菌等，不同菌种培养条件各异，产酶能力亦差别较大。筛选新的产酶活力高、产量高及成本低的脂肪酶生产菌种，或者利用基因工程手段对现有产酶菌种进行改造，提高产酶量等仍需继续深入研究。

　　酶学性质研究是对酶进行合理应用的前提，上述大部分研究报道中纯化后的酶纯度不高，甚至有些是以发酵液为研究对象。因此，不可避免会有其他非目的物的污染和干扰，在实际应用时极容易导致无法出现重现性，从而，进一步影响酶的应用，所以，对酶的高效纯化是亟需解决的问题，随着生物分离技术的不断发展，现在综合 2 种甚至 2 种以上分离模式的集成化分离手段已经快速的发展起来，可以尝试在脂肪酶的分离中进行应用，从而达到快速和高效分离酶的目的。

　　参考文献
　　
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　　[2]Gilberto V C,Viviane L V,Evandro A L,et al. Com-paring submerged and solid - state fermentation ofagro - industrial residues for the production andcharacterization of lipase by Trichoderma harzianum[J]. Annals of Microbiology,2013,63（2）：533 -540.
　　[3]周换景，何腊平，张义明，等。 脂肪酶高选择性催化研究进展[J]. 粮食与油脂，2013,26（5）：1 -4.
　　[4]Long Zhangde,Xu Jianhe,Pan Jiang. Significant im-provement of Serratia marcescens lipase fermentation,by optimizing medium,induction,and oxygen supply[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2007,142（2）： 148 - 157.