动态调控合成生物学元器件研究综述

　　近年来， 合成生物学受到世界各国的广泛关注，发展十分迅速。 人工合成生物体系不仅可用于理解生命本质， 还为发展先进生物制造与诊疗技术、催生新的生物产业革命、促进经济可持续发展提供重大机遇。 目前， 国际合成生物学的研究存在代谢调控两种发展方向。 代谢和应答是生命的基本特征。 生命体能够有效利用环境中的物质与能源进行新陈代谢活动，精准地处理体内外的各种信息并对生命活动进行动态的调控。 合成生物体系也应具有相应的代谢与应答调控特征（图 1）。 （ⅰ） 可通过人工代谢途径的构建，改变物质流动方向， 进而发展生物化工产品、药物等代谢物的生物制造技术。 （ⅱ） 通过动态可控的元器件及人工调控系统， 调控信息的流动使之对体内外环境动态应答， 可用于对生命行为的理解与操纵。

　　1 动态应答人工生物系统的需求与挑战

　　生物代谢通路调控网络的模块化设计和优化是国内外合成生物学研究的主要方向之一， 已有多种生物药物、生物基化学品都被微生物高效表达并展现出很好的应用前景。 随着被操纵基因数目增多和代谢通路的复杂化[1,2], 人们发现利用调控元件精细地调整各个基因间比例关系， 可使代谢流通畅和高效[3~5]. 最近代谢通路的设计又出现了由静态到动态调控演化的趋势， 例如， 利用感应元件动态地感知和平衡不同代谢通路[6], 或防止有害中间物的胞内积累[7]. 在我国， 国家科技计划已立项的项目大多偏向细胞代谢途径改造， 即通过改变细胞内物质的流动方向， 发展各种生物能源、生化工程产品、创新药物与生物材料的生物制造， 其中少量项目中有关于合成生物体系对体内外环境动态应答的研究内容， 但都不是主要研究方向。

　　人工调控系统的基础研究在国际上一直是合成生物学主要发展方向之一。 人们成功设计构建了各种逻辑门、计数器、振荡器、信号过滤器、时空斑图等基因回路[8~11], 为发展复杂的合成生命体系打下了基础。 自然界中的生命有机体的应答与调控是极度动态和时空精密的， 如新陈代谢、生物节律、细胞分化与死亡、发育。 一旦调控出现紊乱， 就会导致疾病的发生。 可与人体相互作用并进行调控的人工生物系统为疾病的干预提供了新的可能性。 疾病干预方面， 合成生物学更是面临简单到复杂、静态到动态的挑战。 相比微生物细胞， 动物活体具有更复杂、动态的组织形式和行为。 国际上在合成生物学的医学与健康干预应用的尝试正不断增多， 有力推动了发展动态可控的复杂人工生物系统的需求。 人们已经在试图发展更加复杂的动态调控基因回路， 用于抑制蚊子（Culicidae）群体的繁衍控制传染病扩散[12]、激活免疫细胞， 其特异性免疫治疗效应[13]、识别与杀死肿瘤细胞[14,15]、调节体内代谢紊乱[16,17]等。

　　其中， 利用合成生物学技术干预糖尿病是国际研究的热点。 人体内的糖代谢受饮食、运动、节律等诸因素影响， 被复杂的动态应答生物网络所调控。 血糖、胰岛素等参数具有强烈的动态性， 而在糖尿病患者身上， 血糖的控制发生了失调， 促进糖尿病发展及心血管等各种并发症发生。 早期的严格血糖控制不仅可以缓解糖尿病早期患者的病情与进展， 还可以有效预防糖尿病前期患者发展为糖尿病。 但是由于患者糖代谢的动态变化和个体差异， 口服降糖药和胰岛素等外源性药物的作用难以与体内血糖的变化吻合， 导致临床干预时血糖降低不足影响治疗效果，或是血糖过度降低产生严重副作用。 人源的胰岛或胰腺移植可以有效治疗 1 型糖尿病， 但受供体组织来源、胰岛脆弱性的限制而很难推广[18]. 利用生物微反应器技术， 可将异源胰岛包封在选择透过、免疫隔离的高分子材料亲水膜内， 移植到患者体内发挥治疗作用。 在大鼠（Rattus norvegicus）、狗（Canis lupusfamiliaris）甚至是猴（Primates）的 1 型糖尿病模型中，含有胰岛的生物微反应器可将血糖降低到正常水平，改善症状并维持数月[19]. 2009 年美国国立卫生研究院（National Institutes of Health, NIH）、食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）已经启动微囊化猪（Sus domesticus）胰岛移植治疗 1型糖尿病的临床试验方案和细节设计[20], 在新西兰微囊化猪胰岛产品已经进入二期临床研究。 在人工胰岛功能的细胞方面， 20 世纪 90 年代就有人尝试利用 S-14 等葡萄糖响应的启动子来控制转基因的肝脏细胞内的胰岛素合成[21], 并在动物模型上实现了对 1 型糖尿病的长时间干预[22]. 虽然启动子、mRNA 等元件可进行优化， 但这些系统响应速度仍较慢， 难以做到快速动态的血糖控制[22,23]. 有人构建了能够响应脂肪酸而动态释放食欲抑制药物普兰林肽的器件[24], 在小鼠（Mus musculus）上可减轻肥胖症状， 对糖尿病干预也有一定的应用潜力。 但是， 这些合成生物器件仍然缺乏快速、定量干预血糖的能力。 近期， 瑞士科学家与本研究组分别构建了光控合成生物学线路， 有效控制了糖尿病小鼠体内的血糖浓度（图 2）[16,17]. 前者涉及复杂级联信号转导途径， 易受内源信号干扰， 难以优化； 后者则简单且模块化强， 更容易调控。 此外，结合纳米技术与生物技术， 可用射频信号激活应答调控系统， 也可控制胰岛素的释放[25]. 这些研究为动态调控人工系统应用于人类糖尿病治疗提供了有力支持。
　　
　　2 动态调控合成生物学元器件

　　人工生物系统需要按照可设计、程序化的工程化方式来实现动态应答的合成生物器件与网络。 这些系统通常包含感应元件、信息整合与处理器件、以及应答元件， 这些元器件可以动态感知物理、化学信号，处理与整合这些信号， 并输出动态模拟信号。

　　2.1 动态应答基因线路

　　各种元器件组装成的基因线路是动态应答人工生物系统的核心， 可完成多种调控功能。 基于转录调控元件的遗传双稳态[26]和基因振荡器[27]是合成生物学领域奠基型的两个器件。 此后相继发展了信号过滤器、时空斑图等可控合成生物器件。 最近， 人们已经能够利用合成生物学正向工程和逆向工程的方法，实现了由多个功能模块耦合而成的、具有“按钮式开关”功能[28], 或者可同步化的时钟[29], 使细菌的基因表达呈现出复杂的时序逻辑模式。 甚至可以把多个逻辑门和双稳态组装成具有极其复杂应答功能的动态调控系统， 如具有巴甫洛夫条件反射式的应答行为的调控网络[30].

　　由于基于转录调控的基因线路应答时间通常大于 30 min, 为了实现更快的动态调控， 基于 RNA 的转录后调控器件也开始出现[31]. 利用正交的核糖体RNA-mRNA 正交对和利用不同的正交对拓扑结构，人们构建了多个翻译水平的逻辑门[32]; 基于核糖开关（riboswitch）的调控机制也可得到模块化的核糖调控子， 执行反义RNA调控和短链RNA调控等多种形式的转录后调控。 人们利用这些核糖调控子还搭建了可以计数的基因网络， 该网络可以针对时间序列上不同位置的同一种信号做出不同的响应[9]. 基于蛋白相互作用或修饰的应答过程速度更快， 其中， 基于光敏元件的开关时间甚至可以达到毫秒级。 因此， 对蛋白质相互作用系统进行重新编程也是合成生物学的一个重要的方向。 如Lim研究组[33,34]在酵母细胞内将丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinase, MAPK）信号转导通路的支架蛋白改造为工程化的合成支架蛋白， 作为空间上区域化的信号节点，将原本基于支架蛋白的反应整合在一起， 得到完全依赖于蛋白质相互作用的， 可重新编程配置的人工信号通路， 实现了逻辑门、超敏开关等具有时序和动力学行为的生物器件。