动态调控合成生物学元器件研究综述(2)

　　目前已有的调控器件绝大部分都是离散型， 以开关的形式控制， 缺乏对输入与输出模拟信号的处理能力。 天然的调控系统面对的通常是定量性的信号， 会针对不同强度的输入信号作出不同程度的响应。 例如， 胰岛细胞可针对不同的血糖浓度， 释放出不同的胰岛素用于调控。 最近， 欧阳颀课题组[35]在细菌内设计实现了具有“半对数”计量响应曲线的感受器网络， 被认为突破了采用模拟信号的基因调控网络的设计局限。 有人报道了一个能够感应 4 个数量级的浓度变化的模拟信号应答系统， 能够完成精密信号的加法、除法和幂率等计算过程[36]. 在定量调控方面， 光敏调控的元器件由于可以被不同强度、不同时间的光照定量激活， 因而具有明显的优势。 这些模拟信号应答系统可承载更多信息量， 可依据输入信号的水平对输出信号进行定量的控制， 是动态应答合成生物系统发展的重要趋势， 发展相关的设计理论与组装工程化原则具有重要意义。

　　2.2 光敏调控元器件及光遗传学

　　光遗传学这一新兴学科是通过在细胞内导入遗传编码的光敏蛋白， 利用光对细胞内的分子活动直接进行特异、快速、远程、可逆、定量、定位的实时控制。 神经科学是最早广泛应用光敏蛋白的领域， 利用改造过的感光离子通道， 可在毫秒量级内， 用光刺激激发或抑制特定类型神经细胞的活动， 从而能准确地探索不同类型的细胞在神经环路中的作用， 例如， 用激光控制斑马鱼（Barchydanio rerio var）的心脏跳 动 , 用 光 控 制 秀 丽 隐 杆 线 虫 （Caenorhabditiselegans）的运动方向， 用光改变小鼠抑郁症行为。 光遗传学的影响也迅速扩散到细胞生物学、生物化学与生物物理、发育生物学等核心生命科学领域。 目前，科学家已找到或者人工改造、合成了一些可用于控制细胞运动、神经肌肉动作[37~39]、蛋白质相互作用与信号转导[40,41]、肌动蛋白聚集与细胞运动[42]、蛋白质剪切[43]等光敏蛋白。 2011 年， Nature Methods 将光遗传学评选为“年度研究方法”[44]. 目前光遗传学已经成为了细胞分子活动操纵技术的前沿与趋势， 它引领人们进入微扰生物学时代， 使人类对生命现象在时间和空间尺度上的控制程度达到前所未有的水平，使复杂生物学系统的研究模式彻底改变。

　　光遗传学的基因元器件具有极快的响应速度与定量性， 为合成生物学的研究提供了重要的新工具。

　　但目前光遗传学技术基本都需要针对靶标蛋白进行一对一的设计， 还存在工程化的困难。 近年来， 瑞士、中国与德国科学家分别发展了动物光控基因表达系统[16,17,45], 可用于控制一切基因表达和几乎一切生命活动， 为光遗传技术的更广泛的应用提供了很好的条件。 其中， 杨弋等人[17]发明的 LightOn 光控基因表达元件受到了国际同行的广泛关注， 已有 170 余研究组进行跟踪应用。 最近有人在 Science 发文， 利用LightOn 技术成功控制了神经干细胞的命运， 并认为该系统“可用于再生医学技术”[46]. 但这些技术还需要进一步优化与正交化， 在光控蛋白的激发波长、动力学参数等方面有更好的多样性以供选择。 此外， 针对蛋白质合成、蛋白质降解、细胞增殖分化与凋亡等生物学过程的通用光遗传学技术仍然十分缺乏。 这些问题都需要用合成生物学模块化、工程化的理念予以解决， 设计与筛选光可控功能蛋白质分子。

　　光遗传学交叉性也很强， 涉及到物理、化学、信息等学科。 科学家们开发了各种创新的光传导与操纵技术、设备与信息系统。 例如， 2013 年哈佛大学的研究人员则结合研发出了一种原位形成的“光导凝胶”[47], 实现了在动物体内同时对光学信号检测和控制的功能。 利用光学探针的感知和光敏蛋白元件的操控性能， 可以用计算机系统及光信号对生物体系进行实时反馈控制[48,49]. 最近， 有人甚至利用脑电信号，以光为媒介， 控制了合成生物体系内特定基因的表达[49]. 这种用光信号连接的实体电子线路和生命调控系统交互回路， 是合成生物学一个新的发展方向。

　　2.3 化学信号感受的优质动态调控元器件

　　如何获得优质可感受化学信号的调控元器件，是发展动态应答合成生物系统的重要任务。 人们已经发展了感受外源化学信号如糖类、抗生素、激素及金属离子等、操纵基因表达的体系， 其中一些在合成生物学体系中作为工具元件广泛应用。 然而， 常用工具元件只响应有限的几种外源化学信号（如异丙基-b-D- 硫 代 半 乳 糖 苷 （isopropy-b-D-thiogalactoside,IPTG）、四环素、雷帕霉素、茶碱等）。 尽管基于这些工具元件可以人为地干预细胞过程， 但并不能做到真正的动态调控： 即让细胞对自然环境中的特定代谢物进行原位应答。 虽然近期人们又发展了感受脂肪、色氨酸、尿酸等内源代谢物的转录元器件[24,51,52],但目前仍然缺乏针对葡萄糖等核心代谢物快速响应的动态调控元器件。

　　在天然有机体中， 存在感受多种化学信号的基因元件， 如直接或间接响应胞内代谢物的启动子或核糖开关、细菌双组分系统与趋化系统等。 但这些元件大多存在反应时间长、泄漏高、正交性低、适配性差、不可预测等诸多问题。 利用化学信号响应天然蛋白获得新的化学调控元件是目前蛋白质研究的重要课题[53]. 从原有性质优异的基因元件出发， 采用设计和定向进化等手段可以针对性地改变其配基特异性；通过结构域重排获得的基因元件， 则能够赋予细胞以新方式响应原化学信号的能力[54]. 近年对蛋白质折叠、天然无结构蛋白等研究导致了一些具有更强模块化特点的新策略， 如可变折叠框架[55]、互斥折叠类型等[56], 这类方法更多依赖于调节蛋白质不同折叠状态的稳定性， 一定程度上避开对蛋白质-配基复合物的结构细节进行设计这一困难问题。 由于近年来蛋白质计算设计方法已发展到能够从头设计出自发折叠成高度稳定的三维结构的蛋白质[57], 把从头设计与基于折叠稳定性的化学信号感知机制结合起来，可能实现模块化设计的人工调控元件。 在人工核糖开关方面， 目前的主要瓶颈是常规适配体筛选技术是以配基-RNA 亲和力为筛选标准的， 目前采用这种方法获得适配体只有极少数适用于构建细胞内分子开关[58].各种不同类型的调控元件性质见表 1.

　　3 总结和展望

　　随着合成生物学的迅速发展， 构建对环境变化及生命信号做出动态应答的合成生物器件已成为可能。 当然， 目前动态应答人工生物系统的构建仍然存在许多问题有待解决， （ⅰ） 缺乏优质感知元件， 即将特定胞内外物理化学信号转化为对特定生物过程调控信息的具体分子元件； （ⅱ） 缺乏模块化地组装精密调控网络的方法和有预测能力的理论模型。 结合对生物医学的重大应用需求， 针对这些瓶颈问题展开深入研究， 系统性地发展可以快速、定量响应内源或外源信号的合成生物学元器件， 将不仅可以推动合成生物学理论和应用的发展， 也为人造生物系统的工程化和实用化发挥关键支撑作用。