实验室验证大肠杆菌在土壤中的热耐受性及其影响因素

　　随着人们生活水平的提高,公众对食品安全的关注越来越高,土壤的生物安全性也逐渐进入人们的视野.细菌感染性疾病有许多是因为食用了被污染的新鲜水果或蔬菜而造成的[1-3].其中与土壤相关的病原体,如病原性大肠杆菌,特别是血清型为 O157:H7 的大肠杆菌(Escherich coli O157:H7),可能给人们的身体健康带来严重的威胁[4-5].Wang 等人发现,E.coli O157 能在牛粪便存活长达 70 天[6],而牛粪等制成的堆肥施用于土壤,有可能造成土壤污染.目前,对 E.coliO157 的研究主要都集中在医学、水环境和有机废物上,但对土壤中大肠杆菌生存状况的研究则较少[7-9].本研究用环境污染指标菌--大肠杆菌作为研究对象,在实验室验证大肠杆菌在土壤中的热耐受性及其影响因素, 以评估 E.coli K12和 E.coli O157 的生存条件.

　　1 材料与方法

　　1.1 供试土壤

　　采集的土壤在 105℃下干燥 10 h,在干燥器中通过孔径 1mm 的筛子过筛后,放入试剂瓶中,在 121℃高压锅中灭菌15 min,最后储存在 4℃的冷藏柜中以供使用.为了获得均匀稳定含水率的供试土壤,使接菌均匀,在大肠杆菌接种的前一天,在土壤中定量加入无菌蒸馏水,分别获得含水率 70%和 40%的两种供试土壤.

　　1.2 菌液的调制

　　以 E.coli K12 菌株(非病原性,来自于日本佐贺大学农学部土壤环境研究室)和 E.coli O157 菌株(病原性,来自于日本产业医科大学产业保健院微生物研究室)作为供试菌株.接种前一天,将保存的 E.coli K12 和 E.coli O157 菌株接种在NB(Nutrient broth)培养基上,在 37℃下经 18 h 和 24 h 培养后,分别得到对数生长期(OD 660,0.35 mmol)和稳定生长期(OD660,0.50 mmol)的菌液.上述菌液用离心机(9000×g,12000 rpm)离心 10 min 后,除去菌液中的培养基,加入无菌生理食盐水(0.85% NaCl )制成菌体的悬浮液,调整至恰当的浓度(约 109cfu/mL).

　　1.3 接种和细菌计数取

　　100mLE.coliK12或E.coli O157的悬浮液(109cfu/mL),分别接种到 0.9 mL 无菌生理盐水溶液、0.9 g 含水率为 70%和 40%的土壤中,浸入 60℃恒温水浴中,受热时长分别为 0、1、2、3、6 和 10 min,进行热耐受性测定.热处理过的样品加入 10 mL 无菌生理盐水,分散处理(15000 rpm,15 min)后,用无菌生理盐水稀释到适宜的浓度,接种到 NA (NutrientAgar)培养基,在 37℃下培养 18~24 h,计算菌数.

　　2 结果与讨论

　　2.1 不同条件下大肠杆菌的热耐受性

　　接种到无菌生理盐水溶液土壤中的 E.coli K12 和 E.coliO157 在 60℃条件下热耐受性如图 1 所示.E.coli K12 在对数生长期的情况下,从初始浓度 108cfu/g 下降到 100cfu/g,在无菌生理盐水约需要 2 min,在含水率 70%土壤中下降更慢,约需 3 min,而在含水率 40%的土壤中,即使经过热处理 10min 后,仍有 103cfu/g 菌体存活(图 1. A).类似的结果也发生在稳定生长期的菌体中,但是稳定生长期的 E.coli K12菌体热耐受性明显高于相同的条件下的对数生长期菌体(图1. B).E.coli O157 热耐受性的情况与 E.coli K12 相似,但其热耐受性比 E.coli K12 强,即 E.coli O157 的存活率更高(图 1. C、D).综其结果,在高温条件下,大肠杆菌在含水率低的土壤中比在含水率高的土壤中热耐受性强,在稳定生长期的大肠杆菌比在对数生长期的热耐受性更强,E.coliO157 菌株比 E.coli K12 菌株热耐受性更高.结果表明,含水率大小是大肠杆菌热耐受性的重要影响因素,显示了在高温环境下,对大肠杆菌来说,土壤含水率越低,存活率就越高.

　　2.2 D 值的计算

　　D 值(Decimal reduction time,DRT)是指一定的热力致死温度条件下细菌密度降低至初始密度的 1/10 所需的时间(即死亡 90%所需时间).根据图 1 所示的热耐受性曲线,计算出 E.coli K12 和 E.coli O157 的 D 值如表 1.

　　在生理盐水、70%含水率土壤和 40%含水率土壤中,60℃下对数生长期 E.coli K12 的 D 值分别为 15.0、15.4 和 109.9sec,E.coli O157 的 D 值分别为 17.2 、40.0 和 136.4 sec.同样,在同一温度下的稳定生长期 E.coli K12 的 D 值分别为22.1、29.0 和 122.4 sec,E.coli O157 为 30.4、61.6 和 215.9 sec.

　　40%含水率土壤中的大肠杆菌 D 值远高于在盐水中和 70%含水率土壤中的大肠杆菌 D 值,稳定生长期大肠杆菌的 D 值比在对数生长期高.结果表明,含水率 40%土壤中的 E.coliO157 的 D 值是含水率 70%土壤中的 3 倍,而 E.coli K12 则是 3~6 倍,换言之,在低含水率土壤中可以提高大肠杆菌的热耐受性,这表明温度以外,适当的水分管理也同样重要.

　　据报道,60℃致死温度下杀灭大肠杆菌的必要时间介于15~20 min,55℃下需要 1 h[10].从上述得到的 D 值计算,大肠杆菌从 108cfu/g 下降到 100cfu/g,E.coli K12 需时 16.3min,E.coli O157 需时 28.8 min,与已有的报道大体一致.因此在理论上,所有的大肠杆菌细胞在土壤温度高于 55℃时应该在几个小时后被杀灭,然而事实上,一些土壤环境中的大肠杆菌,即使温度高达 54℃~67℃仍然能够存活下来[11],这用土壤含水率低和处在稳定生长期等理由还不能完全解释,可能还有其他影响因素,比如 VBNC 状态而导致大肠杆菌残存于土壤.

　　3 结论

　　在热处理过程中,高含水率土壤中的大肠杆菌比低含水率土壤中的大肠杆菌热耐受性低,对数期大肠杆菌比稳定期的热耐受性低,E.coli K12 比 E.coli O157 的热耐受性低.基于 D 值计算,E.coli K12 和 E.coli O157 的完全致死时间分别是 16.3 min 和 28.8 min.

　　参考文献:

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