苏云金芽胞杆菌解毒Cr（Ⅵ）转座子插入位点测定及其表型变化

　　铬是电镀等制造业的副产品， 在环境中会积累， 并可能影响土壤肥力和微生物活动， 造成作物产量损失。 废水中的铬存在形式主要有 Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）2种， 其中, 以Cr（Ⅵ）的毒性最大, 约 Cr（Ⅲ）的 1 000 倍。 把有毒性的 Cr（Ⅵ）还原成 Cr（Ⅲ），是处理含铬废水最常用的方法之一。 其中， 细菌处理法越来越引起人们的重视。 研究已发现许多细菌在有氧/无氧条件下具有将 Cr（Ⅵ）还原为 Cr（Ⅲ）的能力。 大部分的细菌Cr（Ⅵ）还原为酶促反应。 在有氧条件下 ， Cr（Ⅵ）还原酶以内源电子 、NADPH、 NADH 作为电子供体来还原Cr（Ⅵ）。 许多 Cr（Ⅵ）还原酶随着科学的发展不断被鉴定， 如硫辛酰脱氢酶、 谷胱甘肽还原酶等。 这些酶一般都具有 NADH： 黄素氧化还原酶活性， 以Cr（Ⅵ）作为其电子受体， 生成黄素半醌和Cr（Ⅴ）。 另外一类铬或醌专性的还原酶（ChrR、 YieF 和 NfsA）可以将 Cr（Ⅵ）还原为Cr（Ⅲ）。

　　苏 云 金 芽 胞 杆 菌 （Bacillus thuringiensis， Bt）是目前研究最为深入、 应用最广泛的微生物杀虫剂之一。 Sahin 等和周学永等分别研究了 Bt 对 Cr（Ⅵ）的动力学吸附过程。 2010 年， 黄天培等证明了 Bt 菌株普遍具有将Cr（Ⅴ）还原为 Cr（Ⅲ）的能力， 明确了细胞色素氧化酶亚单位 I 可能参与还原Cr（Ⅵ）的调控。 在此基础上， 研究从 Bt 407mini-Tn10 转座子随机突变体库获得了 9 株 Cr（Ⅵ）还原能力极显着提高的突变株（p<0.01）， 测定了其转座子插入位点， 并研究了其表型变化， 为构建高效解毒Cr（Ⅵ）工程菌奠定了新候选基因的基础。

　　1 材料与方法
　　
　　1.1 材料
　　菌 株 ： Bt 菌 株 407（法 国 农 业 科 学 研 究 院Micalis 研究所 GME 实验室 Didier Lereclus 教授惠赠）和大肠杆菌 TG1（商业化菌株， 本室保存）。

　　Luria-Bertani（LB）培养基： 胰蛋白胨10 g（英国Oxoid 公司， 分析纯）， 酵母粉5 g（英国 Oxoid 公司，分析纯）， 氯化钠 10 g（国药集团化学试剂有限公司， 分析纯）， 蒸馏水 1 L， pH7.0~7.2。

　　化学试剂（国药集团化学试剂有限公司， 分析纯）： 90 mg/L 壮观霉素水溶液、 5 mg/mL 红霉素水溶液、 4 mol/L 氢氧化钠、 10 000 mg/L Cr（Ⅵ）、 1 ∶ 1（V ∶ V） 硫酸溶液、 1 ∶ 1 （V ∶ V）磷酸溶液、 2 mg/mL二苯碳酰二肼。

　　1.2 方法
　　1.2.1 Cr（Ⅵ）还原能力具有显着差异的突变株筛选本室前期已参考孙长坡方法构建了 Bt 407转座子随机插入突变体库。 通过 Cr（Ⅵ）的测定检测菌株对铬的还原能力。 以 1％的接种量将菌液转接于Cr（Ⅵ）浓度为 50 mg/L 的 LB 液体培养基中，以野生菌株 Bt 407 为对照， 30 ℃培养 24 h 后测量菌液中剩余 Cr（Ⅵ）的溶度。 六价铬的测定采用二苯碳酰二肼分光光度法。 所有的实验重复 4 次。

　　1.2.2 转座子插入位点侧翼序列的分析 参考QIAGEN 公司 Gentra Purgene Yeast/Bact. Kit 试剂盒进行突变体的总 DNA 提取。 利用 HindⅢ完全酶切突变体总 DNA。 将 5 μL 酶切产物纯化后取 5 μL加入 5 μL Kit Ligation Mix， 于 PCR 仪中 16 ℃自连，转化大肠杆菌感受态细胞 TG1。 利用引物E1（5′-CGTTGGCCGATTCATTAATGC-3′）和 E3（5′-CGATATTCACGGTTTACCCAC-3′）进行 mini-Tn10 侧翼序列的扩增， 并测序。 通过 BLAST 分析序列同源性，确定转座子插入位点。

　　1.2.3 Bt 407及其突变子的表型分析 将 Bt 407及其突变株的甘油菌活化过夜， 1％接种至 100 mL的 LB 中， 30 ℃ 230 r/min 震荡培养， 每隔 1 h 测定OD600， 直至 12 h， 测定生长曲线测定。 以 1％的接种量将突变株菌液转接于含有 50 mg/L Cr（Ⅵ）的LB 液体培养基中， 以野生菌株 Bt 407 为对照， 30 ℃培养 24 h 后测量反应液中总铬溶度。 总铬浓度采用高锰酸钾高温氧化及二苯碳酰二肼分光光度法于540 nm 波长处测定。 所有的实验重复 9 次。

　　1.3 数据处理与分析
　　利用 SPSS 13.0 计算 SEM 和 LSD。

　　2 结果与分析
　　2.1 Cr （Ⅵ） 还原能力差异突变株的筛选从构建的容量为 1500 个克隆的 Bt 407 插入突变体库突变体库中筛选突变株， 测定其解毒 50 mg/LCr（Ⅵ） 24 h 后反应液剩余的 Cr（Ⅵ） 浓度， 从中筛选出 Cr（Ⅵ）还原能力与 Bt 407 野生株相比具有极显着提高（p<0.01）的突变株 9 株， 命名为：Bt 407-Cr5、 Bt 407-Cr15、 Bt 407-Cr22、 Bt 407-Cr90、 Bt 407 -Cr108、 Bt 407 -Cr215、 B t 407 -Cr259 、 Bt 407 -Cr279 和 Bt 407 -Cr281。 野生株Bt 407 在接种量为 1％， 温度为 30℃， Cr（Ⅵ）浓度为50 mg/L 的条件下培养 24 h 后， 将 Cr（Ⅵ）的浓度降解至 7.5mg/L， 而 9 株突变株在相同条件下降解至低于 2.5 mg/L， 与野生菌株均有极显着差异（p<0.01）。

　　2.2 突变体转座子插入位点侧翼序列克隆Bt 407 基因组中含有许多 Hind Ⅲ 位点 ， 而mini-Tn10 中不含有该位点。 提取上述 9 株 Bt 突变株的总 DNA， 经 HindⅢ完全酶切， 再将完全酶切产物自连、 转化大肠杆菌 TG1。 提取大肠杆菌 TG1转化子质粒， 并以 e1/e3 为引物扩增得到 mini-Tn10转座子的侧翼序列 DNA 片段， 大小约为 2 kb， 用HindⅢ酶切进行验证， 说明总 DNA 经 HindⅢ完全酶切后的自连产物已成功导入大肠杆菌 TG1。
　　
　　2.3 mini-Tn10转座子侧翼序列分析以 e1/e3 为引物， 获得 9 株 Bt407 突变株的mini-Tn10 侧翼核苷酸序列。 通过与 Bt407 全基因组 BLASTN 同源性比较发现， 其插 入位点均为假 定 的 肽 链 内 切 酶 （putative endopeptidase）yddH基 因 第1 009~1 017 bp 的 “GTACCTGTA”。

　　该基因位于 Bt 407 质粒 BTB_78p（GenBank登录号CP003891.1）的 40 940~42 433 bp 上。2.4 Bt 407及其突变子的表型分析在本试验中的 9 株突变子在 24h 后能将 50 mg/LCr（Ⅵ）解毒至低于 2.5 mg/L， 与野生株 Bt 407 Cry-相比提高了 3 倍多。 这可能是突变株的还原能力增强， 也可能是其生长速度较野生株 Bt 407 快， 或者是突变株对 Cr（Ⅵ）具有吸附作用。 研究结果表明， Bt 407 及其 9 株突变子的生长曲线十分相近， 排除了是由于菌种密度升高的原因。9 株突变子与野生株的总铬变化不大 ， 都在 50mg/L 左右波动， 说明主要解毒机理是还原Cr（Ⅵ）。

　　3 讨论与结论
　　
　　转座子作为一类可改造的分子工具， 其探索已知基因的新功能和未知基因功能的强大能力随着功能基因组学研究展开得到人们的青昧。 2008 年，Branco 等将 Tn5 转座子随机突变载体pSUP5011 转化苍白杆菌 5bvl1， 建立了一个容量为 4 000 的突变体库， 鉴定了高度耐铬的苍白杆菌 5bvl1 中铬抗性 基 因 的 转 座 位 点 （TnOtChr） ， 验 证 了 其 中 的chrB、 chrA、 chrC 和 chrF 基因的功能 。 mini-Tn10转座子在芽孢杆菌的功能基因组研究中应用非常广泛 。 如 Ghelardi 等利 用 该 mini -Tn10 转 座 子pIC333 发现了编码 Bt 鞭毛蛋白的 fhlA 基因。 本研究从基于 pIC333 构建的 Bt407 突变体库中筛选出9 株 Cr（Ⅵ）还原能力极显着提高的突变株 ， 根据Bt 407 全基因组的预测注释分析了转座子 mini-Tn10 插入位点侧翼序列， 将插入位点均确认为假定的肽链内切酶 yddH 基因第 1 009~1 017 bp 的“ GTACCTGTA” 。 已 发 现 枯 草 芽 孢 杆 菌 （Bacillussubtilis）肽链内切酶 YddH 可水解细胞壁。 将 Bt407 肽链内切酶 YddH 氨基酸序列进行 BLASTP 比较， 发现其高度同源序列均注释为接合转移蛋白（conjugation protein）， 与枯草芽孢杆菌肽链内切酶YddH 同源性很低。 因此， 该 Bt 407 基因是否具有肽链内切酶功能或接合转移蛋白功能需要进一步实验验证。 已知在接合转移蛋白介导的接合转移作用下， 蜡样 芽 胞 杆 菌 组 （Bacillus cereus sensu latofamily）的细菌间可以进行基因库之间的交流及协同进化； Bt 和蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）可以在河水、 土壤、 食品、 昆虫肠道中交换遗传物质； 炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）毒素基因或整个毒素质粒可以接合转移到其他的芽孢杆菌， 反之， 其他细菌的基因或质粒也可以接合转移到炭疽芽孢杆菌。 这导致人们对利用传统方法区分炭疽芽孢杆菌与蜡样芽胞杆菌组细菌正确性的担心 。

　　Bt 是应用最广泛的微生物农药之一 ， 也是作物土壤习居菌， 对人无致病性， 且能高效还原 Cr（Ⅵ）， 是治理Cr（Ⅵ）污染的理想材料之一。 本研究基于转座子技术发现了 yddH 的缺失可能极显着提高了 Bt 对 Cr（Ⅵ）还原能力（p<0.01）。 因此， 转座子技术可为构建高效解毒Cr（Ⅵ）工程菌构建提供新候选基因资源。 后续实验将利用该基因活性恢复突变体和超表达突变体来确认其对 Cr（Ⅵ）还原的调控功能， 获得高效解毒 Cr（Ⅵ）工程菌， 明确其是否具有肽链内切酶功能或接合转移蛋白功能。

　　参考文献
　　
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