福建栓菌的多样性及其之间的相互关系

　　栓菌（Trametes Fr.）由 Fries 于 1835 年建立，模式种为香栓孔菌〔T. suaveolens (L.) Fr.〕。 栓菌的价值较高，应用范围广泛，其主要应用于漆酶、燃料脱色、药用等诸多方面，例如，云芝的药用效果显着。 近年来，应用菌丝体发酵进行提取，已开发出很多种抗癌药。

　　该属在分类学上属于真菌门 （Eumycota Traub）担子 菌 亚 门 （Basidiomycotina Ainsw.） 非 褶 菌 目（Aphyllophorales Rea） 多 孔菌科 (Polyporaceae Fr. exCorda)，其物种多样性十分丰富，目前在 MycoBank 数据库 共记载了 859 条栓菌记录 ， 在 Index Fungorum 数 据 库 中有 831 条记录。 实际上该属只有约 50 个种，其中 9 个种为药用真菌。

　　近 30 年里，栓菌的一些新种和新纪录种被描述，同时对于一些之前描述过的种的模式标本的研究也在开展中。 总的来说，我国的栓菌很丰富，在已被报道的41 个种中有 27 个种是在我国发现的。

　　栓菌具体种的划分还比较混乱，多数研究者认为栓菌是多孔菌科中最不易划清属界的一个类群。 造成这个问题的原因是目前对栓菌的鉴定主要还是基于形态学特征，这对于栓菌的某些近缘种的鉴定比较困难。 近年来，随着分子生物学的发展 ，真菌系统发育学的研究也日渐深入，对栓菌的分子系统学研究也是如此。 Ko 等应用核糖体小亚基(mtSSU)序列对栓菌进行了系统发育学研究；Toms姚ovsky 等利用核糖体的 LSU 和 ITS 序列对欧洲的栓菌进行了系统发育学研究。 张小青等应用 ITS 序列分析了我国栓菌各种之间的亲缘关系。 Justo 等研究了栓菌及其近缘属的系统发育关系， 发现大多数栓菌的种聚类在trametoid clade。 而李海 蛟在加入了更多相似类群后构建的系统发育树中发现褐孔菌属 （Lenzites Fr.）和红孔菌属（Pycnoporus P. Karst.）与栓菌的种聚在一起。

　　对于福建地区栓菌的相关研究与报道不多， 但也显示了福建栓菌的多样性。黄年来等以武夷山等自然保护为标本重点采集点，结合闽南、闽东、闽中、闽西、闽北各地采集并鉴定了福建省大型真菌，其中栓菌有 6个种，包括云芝〔T. versicolor (L.) Lloyd〕、肉色栓菌〔T.dickinsii Berk.〕、偏肿栓菌〔T. gibbosa (Pers.) Fr.〕、 灰栓菌〔T. griseo-dura (Lioyd) Teng.)、东方栓菌〔T. orientalis(Yasuda) Imaz.〕和香栓菌〔T. suaveolens (L.) Fr.〕。 此外一些针对全国范围内木腐菌的报道也提到一些栓菌，而这些栓菌有些在福建也有分布。 2012—2013年，在对福建省福州市和闽南地区 3 个城市（泉州市、厦门市和漳州市） 市区木腐菌的调查研究中发现 6 种共 19 个栓菌的样本。 在总结前人对福建栓菌的研究中统计出目前在福建发现的栓菌一共有 21 种左右，超过全国已知栓菌的 70％，但是报道都是比较零散的。 本文在前人研究的基础上，总结福建栓菌的多样性；并结合试验所得的 ITS 序列和 GenBank 里的福建栓菌相应种已有的 ITS 序列，构建系统发育树，以从分子生物学的角度理清福建栓菌的多样性及其之间的相互关系，最后，对福建已知的 21 个栓菌做分类检索表。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料
　　19 个供试栓菌的子实体，于 2012—2013 年采自福建地区，用于系统发育分析的序列信息见表 1。【表1.略】

　　植物基因组 DNA 提取试剂盒、 胶回收纯化试剂盒、2×Reaction Mix、DL 2000 Marker 均购于天根生化科技 ( 北 京 ) 有 限 公 司 ； 常 用 引 物 ITS4 (5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和 ITS1F(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')购于铂尚生物技术（上海）有限公司。

　　1.2 试验方法
　　1.2.1 DNA 提 取 采集子实体 0.5 g 左 右提取 DNA，DNA 提取使用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因组 DNA 提取试剂盒进行。

　　1.2.2 PCR 扩增 以 ITS 通用引物 ITS1F/ITS4 对供试材料进行 PCR 扩增。扩增体系在 Hu 等用的体系上加以 修 改 ：mix：12 μL，ITS1F/ITS4 引 物 各 1 μL，ddH2O10.5 μL，DNA 模板 0.5 μL，反应总体积 25 μL。 PCR 反应程序：94℃ 5 min；32 个循环（94℃ 30 s，56.5℃ 30 s，72℃ 1 min）；72℃ 10 min。 PCR 产物检测浓度和纯度后进行纯化，然后送往铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序。

　　1.2.3 ITS 系 统发 育 分析。。 将测序得到的 ITS 序 列使用 Bioedit 软件打开，检查碱基的读取是否正确，并将序列前后信号不好的碱基删除； 从 GenBank 中通过Blast 检索获得相似度较高且可信度高的参考序列和适当 的 外 群 种 ， 用 Clustalx 软 件 进 行 多 重 对 位 排 列（Multiple alignments）， 再用 Bioedit 对已经比对好的序列进行必要的手动修正，然后用 PAUP 4.0、MrModeltest、MrBayes和 Treeview等软件构建系统进化树并分析序列结果。

　　2 结果与分析

　　2.1 福建栓菌多样性
　　从采样结果来看，福州是栓菌分布最多的地区，采到 的 6 种 栓 菌 在 福 州 都 有 分 布 。 云 芝 栓 孔 菌 (T.versicolor)、 毛 栓 孔菌 (T. hirsuta) 和 血 红 密 孔 菌 (T.sanguinea)是常见的种，至少出现在两个采样地区。 由于生长环境的不同， 即使是同一个种的子实体在不同环境下也可能出现不同的形态特征。 本研究采集到 6 个种的子实体照片见图 1。【图1.略】

　　目前在福建发现的栓菌有 21 种左右，超过全国已知栓菌的 70％，寄主包括活立木、朽木和建筑木材等，而且在福建大部分地区都能找到栓菌。 因此，福建栓菌的多样性比较丰富。

　　2.2 福建栓菌系统发育树
　　通过在 NCBI 里面查找栓菌的序列，发现福建 21个栓菌有 17 个种有 ITS 序列。 利用 PAUP 4.0 等软件对这些序列构建系统发育树，得到最大简约(maximumparsimony, MP)、最大似然(maximum likelihood, ML) 等 系统 发 育 树 。 通 过 比 较 他 们 的 拓 扑 结 构 ， 使 用Dentocorticium sulphurellum (JN165018) 作 为 外 群 种 ，用其中 1 棵最大简约树用来展现福建栓菌的系统发育情况（图 2），分支处左边的数值为 50%以上的自引导值， 右边的数值为 0.7 以上的 MrBayes 3.0 程序计算出来的后验概率。 从图 2 可以看出，大部分种都能各自聚在一起，但是一些大的分支支持率不高，这跟前人的一些研究有相同之处。 比如，Justo 等通过分析 LSU、ITS、RPB1、RPB2 和 TEF1-alpha 的序列，构建了多棵系统发育树， 发现栓菌是一个多系发育的属，部分栓菌跟其他属混在一起。 另外，Welti 等用 ITS和 RPB2 序列构建栓菌的系统发育树时用到了样本号为 CBS25774 的 T. ochracea（Genbank 里 ITS 序列号为 JN645077）， 在所得的发育树中与 T. versicolor 和其他的 T. ochracea 序列形成支持率很 高的一个分的特征、 孔口的形状和数量和担孢子的大小等对目前已知的 21 种福建栓菌进行分类检索，以方便今后对福建栓菌的鉴定和研究。【图2.略】

　　3 结论与讨论

　　通过总结前人的研究和本研究的结果， 发现福建栓菌的多样性比较丰富，但是分布较分散。 这可能与采样的地区和次数有关。 从本研究发现的 6 个栓菌种来看，在人口密集，生态环境相对恶劣的城市环境中，栓菌的分布相对而言较少。 但是这些为数不多的栓菌却能对树木的生长造成极大的危害， 甚至引起树木的倒塌，对人民的生命财产安全构成极大的威胁。 虽然本研究的 17 个种大部分都能各自形成单独的分支，但是这些种之间的关系却不明朗。 究其原因，一是因为栓菌种类繁多，种类的准确鉴定不容易做到；二是因为栓菌分种的主要形态特征的确定。 因此，除了结合多基因的序列和栓菌的形态特征外， 可能还需要寻求其他的一些方法来找到栓菌的最佳分类方法虽然目前栓菌用于分类的形态特征比较混乱，但是通过子实体的颜色和气味、 菌盖的特征等宏观形态特征， 以及孔口的形状和数量和担孢子的大小等微观形态特征对目前已知的 21 个福建栓菌种编写分类检索表还是很有必要的。 这既是对过去研究的总结，也为将来涉及到福建栓菌的研究提供了一个比较直观有效的分类方法。

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