不同烟支中的微生物数量与种类检测

　　烟草是重要的嗜好品，其质量好坏对吸食者有一定的影响。收获后的烟叶在被加工成烟支商品前必须经过初烤、复烤、储藏、发酵和陈化等过程。由于烟叶吸湿性强，含有微生物生长所需营养物质，如葡萄糖、蛋白质、有机酸、叶绿素、胡萝卜素、烟碱等，因此烟叶在加工、贮运、烟厂生产和烟制品销售等环节中，极易滋生各种微生物而发生霉变。Reid和English等的研究发现,在潮湿、高温或无氧等条件下进行发酵，烟叶中的微生物主要是霉菌，霉菌的生长繁殖造成烟叶腐烂和香气的损失。

　　近年来我国烟草产业发展较快，烟叶、卷烟贮藏的规模和数量越来越大，贮藏时间也相应延长。然而，由于管理和设备等原因，烟叶在贮藏及卷烟在流通过程中遭受霉菌的侵害，发生霉变。据报道烟草行业每年因烟叶霉变造成的损失达70亿元左右。

　　目前我国在烟草霉变成因及防霉保鲜技术研究方面的基础性工作较少，本文选取不同产地和价位烟支进行研究，检测不同烟支中的微生物数量与种类，为研究烟叶和烟支的防霉技术提供基础。

　　1 材料与方法
　　
　　1.1 实验原料

　　1.1.1 样品
　　10 种品牌香烟购自某烟草专卖局烟草专卖店。

　　1.1.2 培养基
　　PCA 培养基、孟加拉红培养基、高盐察氏培养基、氯硝胺18%甘油（DG18）培养基均购自广东环凯公司；马铃薯葡萄糖（PDA）培养基为自制。

　　1.1.3 主要试剂
　　无菌蒸馏水，自制；丙三醇（分析纯），江苏强盛功能化学股份有限公司。

　　1.1.4 仪器与器皿
　　电子天平；超净工作台；电热恒温恒湿培养箱；手提式压力蒸汽消毒器；电热恒温水浴锅；功率调节电炉；拍击式均质器BLSmart；移液枪；移液枪头；培养皿（内径 90 mm，高 16-17 mm）及常用玻璃仪器等。

　　1.2 试验方法

　　1.2.1 样品的预处理
　　在无菌超净台内，将市售香烟外包装拆除。用无菌镊子去除烟蒂及包装纸后，将分离所得烟丝（约10g）置于洁净培养皿中并充分混合。

　　1.2.2 菌悬液的制备
　　参照国标GB4789.15-2010方法，取无菌均质袋，精确称取样品烟丝5.0g置于袋中，并加入95mL无菌蒸馏水，放入均质器中拍打120s。将拍打所得样品悬液取出，用4层无菌纱布过滤于50mL 无菌烧杯中。用移液枪吸取 1mL 菌悬液，加入含有 9mL 无菌水的试管中，振荡10s，依次制成系列梯度菌悬液。

　　1.2.3 微生物培养与分离
　　用移液枪吸取1mL菌悬液于无菌培养皿中，并倾入融化并冷却至 50 ℃ 左右的培养基约15mL。每种样品分别用 PCA、PDA、虎红、高盐察氏、DG18 五种培养基培养，每个稀释梯度制作两个平行平板。待含菌悬液的培养基冷却后，将PCA培养基倒置于37 ℃ 恒温培养箱培养48h，其余 4 种培养基则置于 28 ℃恒温培养箱中培养3-5d，观察菌落的形态数量并记录实验结果。

　　2 结果与讨论

　　2.1 不同品牌烟支微生物检验结果
　　选用PCA培养基用于菌落总数的检测，PDA和高盐察氏培养基用于真菌计数，虎红和DG18培养基用于分离霉菌，其中虎红培养基用于分离一般霉菌，DG18培养基用于分离嗜干霉菌（烟支水分活度较低）。10种烟支样品微生物检测结果如表1所示：成品烟支中细菌含量约 103~104cfu/g，酵母菌含量约 102~103cfu/g，霉菌含量较少。

　　国内对卷烟烟支内微生物研究较少，更多针对的是烟叶中所含微生物。如Tamayo等报道从西班牙醇化烟叶中分离的微生物主要是芽孢杆菌和球菌。韩锦峰等认为，烤烟叶面微生物种群主要包括细菌、放线菌和霉菌三大类，微生物总量一般为5×104~8×104个/克烟叶。其中，细菌占了相当大的比例，达90%~99%；其次为放线菌，占 1%~5%,而霉菌仅占 0~0. 3%。陈福星等发现，在烤烟人工发酵的中期和发酵完成时，烟叶中均存在一定量的微生物，其中以细菌为主，另外还有少量的放线菌和霉菌。【表1】

　　
　　2.2 价格因素对烟支微生物数量影响的分析
　　根据价格将不同品牌烟支分为4个区间：低端（2~5元）、中低端（5~10元）、中端（20~25元）和高端（45~60元）。取各价格区间内品牌烟支菌落数均值，得到不同价格区间烟支中微生物含量表。

　　由表2知，烟支价格在低端到中端区间内，随着价格的增加，细菌和酵母菌菌落数逐渐减少；但随着价格的上涨，即高端烟支比中端烟支相比，细菌和酵母菌落数呈现上涨趋势。而霉菌菌落数未见明显波动。蛋白质含量高的烟叶在吸食的过程中会产生令人厌恶的臭味和辛辣味，故在商品烟叶、烟支中，蛋白质的含量越高，烟叶等级越低。微生物发酵对烟叶品质的提高具有关键作用，这也是高端烟支中细菌和酵母菌数量较多的原因。【表2】

　　
　　2.3 产地因素影响烟支微生物数量的分析
　　选取不同产地的中端和高端烟支进行比较分析，结果如图1所示。由图1知，中端烟支细菌数量因产地不同差异较大，而酵母菌数量未呈现显着变化。图2 不同产地高端烟支微生物菌落数对比(cfu/克)由图2知，高端烟支因产地不同，细菌及酵母菌数量差异明显。【图1-2】

　　结合图1和图2可知，产地对烟支中微生物的数量影响较大。Glenn研究指出，土壤质地是影响微生物生长繁殖的主要生态因子, 因此土壤不同对土壤微生物群落结构有着重要影响。故不同产地烟叶中微生物的种类及数量均具有较大差异，因此加强对种植烟叶的土壤微生物种群和类型的研究，对研究烟叶乃至烟支的微生物种群具有重要的意义。

　　3 结论

　　研究通过对不同市售品牌烟支进行微生物分离检测得出，烟支中霉菌含量约占微生物总量0~0.02%，细菌含量约占90.02~92.38%，酵母菌含量约占 7.62~9.96%。

　　烟支中微生物研究针对不同价格烟支对比分析发现，在低端至中端价格区间内，细菌及酵母菌数量随价格的增加而下降；但高端烟支中微生物数量比中端烟支多，可能的原因是微生物的发酵作用对烟叶品质的提高具有重要影响。针对不同产地烟支对比分析发现，不同地区烟支中微生物种群和数量均有较大差异，差异可能是由于烟叶生长的土壤及其气候等的不同所引起。

　　参考文献
　　
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　　[3]金闻博,戴亚,横田拓等.烟草化学[M].北京:清华大学出版社,2000:57-59.