微生物固态发酵油茶粕中单宁酶含量调控

　　油茶是我国南方地区的一种木本油料作物，油茶粕是油茶经榨油后的残渣，是一种营养价值较高的工业副产品。油茶粕营养成分丰富，主要有粗蛋白 （10%~15%），粗脂肪 （5%），糖类 （30% ~40%）、粗纤维 （15%~20%）和水分 （14%），以及对动物生长发育有利的必需微量元素Mg、Fe、Ca、Mn、Zn、Cu[1].因此，油茶粕是一种优良的天然植物蛋白资源，可作为优质的蛋白饲料源。然而，由于油茶粕中含有茶皂素、单宁等多种抗营养因子，从而限制了其在饲料中的应用。

　　单宁 （Tannin）又称单宁酸 （Tannic acid）、鞣质，是一种广泛存在于植物体内的多元酚类化合物的统称，其相对分子质量一般为500~3000.由于单宁味苦涩影响饲料的适口性，从而降低了动物摄食率[2].过量的单宁还可降低蛋白质、氨基酸的消化率，并损伤肠壁，进而影响动物的生长发育[3]；再者，单宁可与消化道黏膜蛋白结合，形成不溶性复合物排出体外，增加了内源氮的排泄量。研究表明，单宁酶可水解没食子单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖，且单宁酶属于诱导酶，主要利用微生物发酵生产获得[4,5].因此，通过微生物发酵的方法产生单宁酶，促进单宁的有效生物降解，是生产中将油茶粕转化为优质蛋白质饲料源的关键。本研究拟采用发酵过程中可产生单宁酶、发酵能力强的黑曲霉和酵母菌作为菌种[6,7],从温度、pH、发酵时间等因素出发，研究微生物固态发酵中单宁酶产生和单宁降解的最佳条件，并将单宁含量调控到对动物体有益的范围[8],以期为油茶粕作为蛋白质饲料源使用提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料、仪器与试剂

　　1.1.1菌种

　　黑曲霉、酵母菌购于中国工业菌种保藏中心。

　　1.1.2固态发酵培养基油茶粕培养基：油茶粕13g、可溶性淀粉1g、尿素1.5g、磷酸氢二钠0.05g、七水硫酸镁0.015g、牛肉膏0.2g、七水硫酸亚铁0.03g、酵母膏0.5g、蒸馏水100mL,自然pH,121℃灭菌20min.PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15~20g、自来水1000mL,自然pH,121℃灭菌20min.

　　1.1.3种子液的培养

　　酵母种子液的培养：将酵母菌从斜面培养基接种至装有50mL麦芽汁液体培养基的250mL三角瓶中，30℃、160r/min培养24h.

　　霉菌种子液的培养：将霉菌从斜面培养基接种至装有50mLPDA液体种子培养基的250mL三角瓶中，30℃、160r/min培养24h.

　　混菌按照接菌比例1∶1.

　　1.1.4主要仪器设备DA-180M型显微镜、AL204型电子天平、PHS-3C精密酸度计、HH-S型水浴锅、Lac-5060S灭菌锅、Lab-Tech SPX智能型培养箱、HZQ-QG型振荡器、721型分光光度计。

　　1.2发酵条件优化方法1.2.1发酵时间的优化取培养基中的菌液，以10%的接种量接种于油茶粕培养基中，在恒温30℃、pH 5的条件下进行培养，分别在发酵1、2、3、4、5、6d后取样测定单宁的含量。设置未接菌种的油茶粕培养基作为对照组，每个处理3个重复。

　　1.2.2 pH的优化取培养基中的菌液，以10%的接种量接种于油茶粕培养基中，恒温30℃下，分别在pH为3、4、5、6、7、8条件下发酵3d后取样测定单宁含量，设置未接菌种的油茶粕培养基作为对照，每个处理3个重复。

　　1.2.3发酵温度的优化取培养基中的菌液，以10%的接种量接种于油茶粕培养基中，自然pH（pH 6.6~7.0）下，分别在10、15、20、25、30℃和35℃下发酵3d后取样测定单宁含量，设置未接菌种的油茶粕培养基 （发酵温度30℃）作为对照，每个处理3个重复。

　　1.3单宁的测定单宁含量的测定方法采用分光光度法，参照林业行业标准 《单宁酸分析试验方法》 （LY/T 1642-2005）[9]进行。

　　2结果与分析

　　2.1不同发酵时间对不同菌种发酵的油茶粕中单宁含量的影响随着发酵时间从1d逐渐增加 到6d,不同菌种对油茶粕中单宁的分解能力呈现先升高后降低趋势，其中混菌发酵油茶粕单宁含量在3d时降低到最小值0.52%（占油茶粕总量的比例），但随着发酵时间延长至4~6d后，3个处理之间无显着差异 （P>0.05）（表1）.

　　2.2不同发酵pH对不同菌种发酵的油茶粕单宁含量的影响随着pH从3上升到8,不同菌种对油茶粕中单宁的分解能力呈现先升高后降低趋势，其中混菌发酵油茶粕单宁含量在pH为5时降低到最小值，且显着低于对照组和其他试验组 （P<0.05），此时单宁含量为0.51%（表2）.

　　2.3不同发酵温度对不同菌种发酵的油茶粕单宁含量的影响随着发酵温度从15℃上升到35℃,油茶粕中单宁的分解能力呈现先升高后降低趋势。混菌发酵油茶粕的单宁含量在28℃时降低到最小值0.48%,显着低于对照组和其他处理组 （P<0.05）（表3）.

　　3小结与讨论

　　试验结果表明，不同发酵条件下，微生物发酵能够有效降解油茶粕中单宁，且对单宁的降解能力呈现先升高后降低趋势，其中黑曲霉和酵母菌的混菌试验组在发酵时间3d时，油茶粕中单宁含量降低至0.46%,显着高于其他试验组和对照组。发酵时间为4d以上时，各处理组之间单宁含量没有显着差异。

　　综合各菌种在不同时间段对油茶粕中单宁的降解结果，以混菌发酵效果最好，更符合实际生产要求。考虑到发酵时间延长会带来的生产成本的增加，以及油茶粕中单宁含量的升高，较适宜的发酵时间为3d.温度和pH对发酵结果的主要影响是其对微生物的生长和相应酶活性的影响[10].研究表明，真菌和植物产单宁酶pH稳定范围一般在4~6之间[11].当混菌所分泌的单宁酶在pH为5时，有最强的活性。本研究中pH在5左右时，混菌对油茶粕中单宁的分解效果最显着，表明此时混菌分泌的单宁酶有最强的活性。

　　本研究中，发酵起始温度在28℃时，混菌对油茶粕中的单宁具有显着降解效果。这与苏二正等[12]、郭鲁宏等[13]的研究报道结果相符。

　　28~32℃为黑曲霉最佳发酵培养温度范围，可能因为本研究中试验是在三角瓶中发酵，过程中产生了大量的热，而物料的热传导率低，导致短时间内热量难以消散；此外，在发酵过程中物料的收缩和空隙的减少也使热量难以消除，起始发酵温度稍低，经过发酵后发酵瓶内的温度升高，酶活性增强。

　　参考文献：
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　　[8]王挥，张蕾，黎继烈，等.响应面法优化黑曲霉发酵产单宁酶条件 [J].中南林业科技大学学报，2011,31（11）:122~126.
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　　[11]王挥，李应洪，颜红，等.单宁酶性质及其分析方法研究进展 [J].林产化学与工业，2012,4（8）:128~133.
　　[12]苏二正，夏涛，张正竹.单宁酶的研究进展 [J].茶业通报，2004,26（1）:16~19.
　　[13]郭鲁宏.单宁酶的制备及酶法制取没食子酸及其丙酯研究 [D].沈阳：中国科学院沈阳应用生态研究所，2001.