食品微生物实验室CNCA检测能力验证分析

　　能力验证是评价实验室技术能力的有效手段，是实验室通过外部措施对其内部质量控制方法的一种重要补充手段[1-2].参加能力验证，通过对其结果的总结分析，采取纠正和预防措施，能最有效地消除偏差，提高检验人员检测水平，保证检测数据达到检验质量标准[3].2013 年 11 月本中心微生物实验室参加了中国国家认证认可监督管理委员会（ CNCA） 组织的 CNCA - 13 - B09 食品微生物学检测能力验证。2014 年 4 月收到 CNCA 能力验证合格证书，所有检测项目结果均为满意。

　　1 材料与方法

　　1. 1 样品来源及匀液的制备 能力验证样品由中国检验检疫科学研究院提供。4 种样品分别对应 4个检测项目，4 份样品均为白色冻干粉末，标识分别为： 13 - W737 菌落总数、13 - X557 沙门氏菌、13 -Y189 副溶血性弧菌定性、13 - Z001 副溶血性弧菌定量。按照参试指导书说明，将冻干粉末稀释再水化成为 40mL 样品。

　　1. 2 试剂 平板计数琼脂、BPW、TTB、SC、BS、3%NaCl 碱性蛋白胨水、NaCl 胰胨水购自北京陆桥生物技术公司。沙门显色培养基及弧菌显色培养基购自郑州博赛科玛嘉。三糖铁琼脂为英国 OXOID 公司产品，沙门氏菌诊断血清为丹麦 SSI 公司产品。

　　1. 3 检测依据 菌落总数检测依据 GB4789. 2 -2010; 沙门氏菌检测依据 GB4789. 4 - 2010; 副溶血性弧菌定性及定量检测依据 GB/T4789. 7 -2008.

　　1. 4 质控菌株 肠炎沙门氏菌 ATCC 14208、副溶血性弧菌 ATCC 27519 均由北京市疾病预防控制中心提供。

　　1. 5 13 - W737 菌落总数的检测 将样品匀液 10倍系列稀释至 10- 4,每个稀释度分别接种两块平皿，每皿 1ml,同时用生理盐水做空白对照； 注入平板计数琼脂 15 ~20 ml,36℃培养 48 h.挑取菌落数在 30 CFU -300 CFU 之间的平板，计数菌落总数。

　　1. 6 13 - X557 沙门氏菌检测 将样品匀液划线接种到 BS 及沙门显色培养基上。同时取 25 ml 样品加入到 225 ml BPW,36℃ 培养 18 h; 取 1 ml 增菌BPW 分别接种于 10 ml TTB 及 10 ml SC 增菌液，培养后分别划线接种 BS 及沙门显色培养基，挑取可疑菌落进行鉴定。

　　1. 7 13 - Y189 副溶血性弧菌定性检测 将样品匀液划线接种弧菌显色培养基。同时取 25 ml 样品加入到225 ml 3%NaCl 碱性蛋白胨水，36℃培养18 h;划线接种弧菌显色培养基，挑取可疑菌落进行鉴定。

　　1. 8 13 - Z001 副溶血性弧菌定量检测 取 25 ml样品加入到 225 ml 3% NaCl 碱性蛋白胨水中，将该1: 10 匀液 10 倍系列稀释至 10- 3,将每个稀释度匀液分别接种3 支含9 ml 3%NaCl 碱性蛋白胨水的试管，每管接种 1 ml,3 个稀释度样品接种量分别为0. 1 ml、0. 01 ml、0. 001 ml ,36℃ 培养 18 h.每管增菌液分别划线接种弧菌显色培养基，挑取可疑菌落进行鉴定。

　　2 结 果

　　2. 1 13 - W737 菌落总数 13 - W737 样品各稀释度平皿菌落总数（ 表 1） .选取菌落数在 30 CFU ~300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的 10- 2稀释度的平板计数菌落总数。样品 13 - W737 菌落总数报告为 12 000CFU/ ml.【1】

　　
　　2. 2 13 - X557 沙门氏菌检测 样品直接划线接种及经前增菌 - 增菌培养后划线接种 BS 及沙门氏菌显色培养基，经培养，挑取可疑菌落，接种三糖铁琼脂。对可疑沙门氏菌三糖反应的菌落进行生化及血清学鉴定。经 VITEK2 生化鉴定出一株沙门氏菌，血清学结果为： A - S 多价 + ,O4+ ,O12+ ,Hi+ ,H1,2+ .依据生化和血清学结果，该样品检测结果报告为检出鼠伤寒沙门氏菌。

　　2. 3 13 - Y189 副溶血性弧菌定性检测 样品直接划线接种及经增菌培养后划线接种弧菌显色培养基，经 36℃培养 18h 后，无典型副溶血性弧菌菌落生长。结果判定为未检出副溶血性弧菌。

　　2. 4 13 - Z001 副溶血性弧菌定量检测 13 - Z001样品 3 个稀释度 9 支 3%NaCl 碱性蛋白胨水增菌液生长情况及后续目标菌分离及鉴定情况（ 表 2） .经各项试验证实，9 支增菌液中有 2 支为副溶血性弧菌阳性，其样品接种量均为 0. 1 ml.查 MPN 检索表，该 样 品 副 溶 血 性 弧 菌 定 量 检 测 结 果 为9. 2MPN / ml.【2】

　　
　　2. 5 CNCA 能力验证结果评价 CNCA 对能力验证 结果进行了评价，所有项目检测结果均为满意（ 表 3） .【3】

　　
　　3 讨 论

　　能力验证及其他室间比对实验是评价实验室技术能力的重要手段[3-5].实验室每年参加 CNCA 组织的能力验证[6],并以此结果作为重要的外部质量评价活动，对实验室内部质量控制方法的有效性进行判断和监控。

　　菌落总数计数样品 10 倍递增稀释时，要多做几个稀释度匀液，以便选择合适的稀释度进行计数。

　　13 - W737 菌落总数在计数时发现，平板计数琼脂上有两种大小形态不同的菌落。在灯光下仔细观察发现在一些较大菌落上往往有透光性较差的小菌落生长，两种菌落的特殊形态特征及重叠生长增加了菌落计数的难度，如有不慎可能造成计数结果的不准确。此外，影响菌落总数计数结果的因素还有样品匀液的制备、稀释液、计数琼脂、培养温度等[7-8].

　　必须在各个环节做好严格的质控，才能保证计数结果准确[9].

　　按照国标沙门氏菌检验程序，SC 增菌后，用XLD、HE 或显色培养基分离培养。有研究表明[10],在沙门氏菌的分离培养方面，沙门显色培养基的敏感性和特异性都明显高于其他两种分离培养基。因此，能力验证使用显色培养基对沙门菌进行分离培养。由于沙门氏菌抗原结构复杂，其 H 抗原常存在自然变异或结构受损现象[11].加热、乙醇处理、干燥、冷冻等因素都可能使沙门氏菌的鞭毛结构受损，导致抗原性减弱，从而增加误检、漏检情况的发生[12].因此，在增菌前，用 BPW 对样品进行前增菌十分必要，能让沙门氏菌受损的生物性状得到恢复[13].在进行血清学 H 抗原鉴定时，多数可疑菌落仅鉴定出第一相 H 抗原，通过广泛的血清学鉴定，仅在一株可疑菌中检出 H 抗原第二相，据此，完成完整的沙门菌血清鉴定。可见，对于双相 H 抗原沙门氏菌，要多挑取可疑菌落进行血清学试验，增加双相抗原检出几率，避免进行繁琐的位相变异试验。

　　在进行副溶血性弧菌定量检测时，9 支增菌试管均显示有生长。分离培养后，样品接种量 0. 1 ml的 3 支试管所对应的弧菌显色培养基有可疑菌落（ 紫红色） 生长，在每块显色平板上挑取多个可疑菌落进行鉴定。经鉴定，第 1 和第 2 支试管中检出副溶血性弧菌，此外，第 2 和第 3 支试管中还检出温和气单胞菌。由于温和气单胞菌和副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上菌落颜色相似，且三糖铁反应相似，因而增加了能力验证的难度。由于科玛嘉弧菌显色培养基操作简便，结果易于观察，灵敏度和特异性高，广泛用于日常检测。但其也存在一定的假阳性率，某些气单胞菌和假单胞菌可出现假阳性[14-15].

　　因此，需多挑取可疑菌落进行鉴定，防止漏检，保证定量检测结果的准确性。

　　CNCA 能力验证对实验室内部质量控制方法的有效性进行了确认，同时，对于检测人员技术水平的提高和质量管理体系的不断完善起到积极作用。

　　参考文献
　　
　　[1] 席静，张思群，刘静宇，等 . 论能力验证活动对实验室能力建设的作用和意义[J]. 中国卫生检验杂志，2011,21 （ 6） :1576-1578.
　　[2] 中国合格评定国家认可委员会 . CNAS RL02 能力验证规则[S]. 2011.
　　[3] 王宏明 . 微生物检验技术操作规程与质量控制及检测数据分析处理实用手册[M]. 北京： 卫生科技出版社，2007.
　　[4] 茹慧萍，张雪琴，孟丽，等 . 实验室质控在食源性疾病控制中的作用[J]. 公共卫生与预防医学，2012,23（ 1） : 91-92.
　　[5] 蒋卫平 . 做好室间微生物检测能力比对的几个关键点[J].公共卫生与预防医学，2013,24（ 5） : 104-105.
　　[6] 吉彦莉，郭勇峰，王敬辉，等 . CNCA - 12 - A01 食品微生物学能力验证结果分析[J]. 公共卫生与预防医学，2013,24（ 4） : 100-101.
　　[7] 林彩华，许如苏 . 菌落总数检验结果的影响因素与控制措施的探讨[J]. 中国国境卫生检疫杂志，2007,30 （ 4） : 241-242.
　　[8] 王晓红，姜娴 . 食品中菌落总数检测结果的不确定度评定[J]. 中国卫生检验杂志，2011,21（ 11） : 2799-2800.
　　[9] 吕朝阳，方英，吕朝晖 . 两种方法检测食品菌落总数的比较[J]. 公共卫生与预防医学，2006,17（ 4） : 55.