浅谈棕榈酸促进心肌细胞凋亡的作用

　　细胞凋亡论文（期刊推荐范文8篇）之第八篇

　　摘要：目的 本研究旨在探讨棕榈酸 (PA) 对H9C2心肌细胞凋亡的影响及活性氧水平的改变在其中的作用。方法 不同浓度 (0、50、100、200、400、800μmol/L) PA作用于心肌细胞18h, 流式细胞术检测细胞早期凋亡率,DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧水平。结果 PA 50μmol/L时细胞早期凋亡率有所增加,PA 100μmol/L时, 细胞早期凋亡率明显增加, 活性氧水平明显增加,PA 400μmol/L和800μmol/L时细胞密度出现大量减少。结论 PA不同浓度作用于H9C2心肌细胞会导致细胞凋亡, 其原因可能与PA增加细胞活性氧的产生有关。

　　关键词：棕榈酸,心肌细胞,活性氧,凋亡

　　心血管疾病是一种慢性疾病, 主要包括心肌梗死、心力衰竭、血管脂质功能紊乱等, 它是全球第一大死因, 严重危害人类健康[1]。高脂血症是心血管疾病的主要危险因素之一, 维持脂质体内平衡是预防心血管疾病的有效方法[1]。棕榈酸 (PA) 是人类血液中含量最高的一种饱和脂肪酸, 其含量的增加会促进心血管疾病的发生[2,3]。研究表明, 饱和脂肪酸具有导致脂质毒性的作用, 对许多细胞类型诱导内质网应激和细胞凋亡[4]。心肌细胞凋亡在心脏功能紊乱和心力衰竭中具有重要影响, 减少心肌细胞的凋亡可以改善心脏功能和心肌损伤, 有助于减少心血管疾病的发生发展。我们拟用不同浓度PA作用于H9C2心肌细胞, 观察PA对心肌细胞凋亡的影响, 为心血管疾病的防治提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 细胞与相关试剂

　　H9C2大鼠胚胎心肌细胞 (武汉华联科生物技术有限公司) ;DMEM培养基 (低糖, Hyclone公司) ;胎牛血清 (FBS, Gibco公司) ;青/链霉素 (P/S, Hyclone公司) ;0.25%EDTA胰酶 (Gibco公司) ;棕榈酸 (Palmitate, PA, Cat#H8780-100g, Solarbio生物有限公司) ;活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 测试试剂盒 (E004, 南京建成生物技术有限公司) ;AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒 (KGA108, 凯基生物公司) 。

　　1.1.2 主要仪器

　　超净工作台 (苏州苏洁净化) ;CO2细胞培养箱 (美国Thermo公司) ;倒置荧光显微镜 (日本O-lympus公司) ;HVE-50高压灭菌器 (日本Hirayama公司) ;PGYJ-20-AS (超) 纯水机 (武汉品冠仪器设备有限公司) ;CytoFLEX流式细胞仪 (Beckman公司) 。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养

　　用含10%胎牛血清和2%青/链霉素的低糖DMEM培养基培养细胞, 静置于37℃、5%CO2的细胞培养箱, 每两天换液一次, 待细胞生长至融合度为80%～90%时, 用0.25%EDTA胰酶进行消化传代培养, 取对数生长期细胞进行实验。

　　1.2.2 PA的配制

　　将25.6mg的PA粉末溶解于1mL无水乙醇配制成100mμmol/L母液, 使用前用不含饱和脂肪酸的BSA配制成1mμmol/L工作液, 在37℃水浴锅中轻摇混匀使其完全溶解, 使用孔径为0.22m的滤膜过滤备用。

　　1.2.3 实验分组

　　使用PA不同浓度梯度:正常对照组 (control组, 使用DMEM低糖培养基培养) 、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L, 分别培养18h, 进行细胞流式检测;正常对照组、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L, 分别培养18h, 进行细胞ROS检测。每实验重复3次。

　　1.2.4 流式细胞术检测H9C2心肌细胞凋亡

　　将H9C2心肌细胞传代到25cm2培养瓶中, 细胞密度为4×105个/瓶, 待细胞贴壁后将培养液吸出加入含2%FBS的低糖培养基培养1h, 吸去低血清培养基后, 再向每瓶中加入不同浓度含PA的培养液继续培养18h, 收集上清液, 磷酸盐缓冲液清洗细胞两次, 用胰酶消化收集细胞, 加入PBS重悬, 离心弃上清, 按照说明书步骤加入试剂避光反应15min, 于1h内上机检测, 用Flowjo软件分析细胞不同状态, 结果以凋亡细胞百分率表示。

　　1.2.5 检测PA对H9C2心肌细胞活性氧 (ROS) 水平的影响

　　将H9C2心肌细胞传代到24孔板中, 细胞密度为1×104个/孔, 待细胞贴壁后将培养液吸出加入含2%FBS的低糖培养基培养1h, 向接种细胞的孔中加入含不同PA浓度的培养液培养18h后, 弃去培养基, 用PBS清洗细胞两次, 4%多聚甲醛溶液固定细胞10min, PBS冲洗两次, 加入用无血清培养基配至终浓度为20μm/L的荧光探针作用20min, 终止探针作用时, 用PBS清洗细胞两次, 在荧光显微镜下观察并拍照。

　　1.3 统计学分析

　　实验数据采用GraphPad Prism 7.0统计软件进行处理, 数据采用表示, 组间数据比较采用单因素方差分析, P﹤0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 不同浓度PA对H9C2心肌细胞凋亡情况的影响

　　流式细胞仪检测结果显示, 不同PA浓度设定为50、100、200、400和800μmol/L时, 作用于H9C2细胞18h, 从图1A (封二) 第三象限, 结合图1B (封二) 统计图可知, 细胞的早期凋亡率分别为 (2.39±0.8) %、 (5.32±2.37) %、 (10.20±3.54) %、 (8.18±1.03) %、 (8.17±3.98) %、 (3.36±1.46) %, 从结果可以看出, PA浓度为0、50、100μmol/L时, 浓度依赖性的增加细胞的早期凋亡率, 其中PA浓度为100μmol/L时, 细胞早期凋亡率出现明显上升, 与control组相比, 具有显着性差异 (P<0.05, n=3) , 表明不同浓度的PA能导致心肌细胞的损伤。从图1A第二象限, 结合图1C (封二) 统计图结果表明, PA浓度为200、400和800μmol/L时, 细胞的晚期凋亡率与对照组相比有所上升, 具有显着性差异 (P<0.05或0.01, n=3) , 表明PA浓度较大时, 细胞可能出现了大量晚期凋亡或死亡。

　　2.2 不同浓度PA对H9C2心肌细胞ROS水平的影响

　　流式细胞仪检测结果显示50μmol/L浓度的PA没有明显的凋亡, 因而在ROS水平的检测中, 采取从100μmol/L到800μmol/L的PA浓度区间。在倒置荧光显微镜下观察, 对照组荧光强度比较低, 细胞形态比较完整;PA 100μmol/L和200μmol/L浓度时, 荧光强度明显增强, 有较多的细胞形态发生改变, 荧光较亮的细胞体积变小、皱缩变圆和呈破碎状, 见图2 (封二) 。400μmol/L和800μmol/L时, 细胞密度出现大量减少, 荧光强度明显减弱, 此时细胞可能出现了大量的晚期凋亡和贴壁不牢。

　　3 讨论

　　游离的脂肪酸通常在糖尿病和肥胖症中升高, 已被证明会损害内皮功能并引起氧化应激、炎症和胰岛素抵抗[5]。PA是饱和游离脂肪酸之一, 也是膳食饱和脂肪和脂肪的主要成分, 通过诱导血管炎症、细胞凋亡和活性氧的过量产生损伤心血管功能[3,6]。PA可通过抑制自噬活性, 增加心肌细胞中的活性氧物质和引发强烈的内质网应激反应, 加剧心肌细胞凋亡和细胞死亡[7,8]。成人心肌细胞很少增殖, 因此, 心肌细胞的损失最终会导致心脏功能受损。

　　PA作为一种饱和游离脂肪酸, 是许多细胞类型中的细胞凋亡诱导剂[9,10]。PA可能通过损伤线粒体功能诱导ROS的产生, 而不受控制的ROS产生和/或减低的抗氧化防御导致氧化应激, 这已经被认为是一种重要的致病因素[6]。本研究中, 不同浓度的PA作用于心肌细胞可以导致心肌细胞的凋亡, 并伴随心肌细胞活性氧的产生。PA100μmol/L作用时, 与对照组相比, 细胞出现明显的早期凋亡和细胞活性氧的增多及细胞形态的改变;而当PA浓度大于400μmol/L时, 细胞早期凋亡率较100μmol/L时有所减少, 可能是因为PA浓度较大时细胞出现了大量的晚期凋亡。这说明PA诱导心肌细胞的凋亡可能与其增加细胞活性氧的产生有关, 然而其凋亡的具体信号分子通路还有待进一步研究。

　　综上所述, PA不同浓度作用于H9C2心肌细胞会导致细胞凋亡, 其原因可能与PA增加细胞活性氧的产生有关。本研究证实了心肌细胞凋亡与活性氧之间的联系, 并且成功建立了PA诱导心肌细胞凋亡的模型, 为心血管疾病的发病机制研究提供了基础。

　　参考文献
　　[1]XIN M, SUN Y, CHEN H, et al. Propylene glycol guluronate sulfate (PGGS) reduces lipid accumulation via AMP-activated kinase activation in palmitate-induced Hep G2 cells[J]. Int J Biol Macromol, 2018, 114:26
　　[2]LI Y, PENG Z, WANG C, et al. Novel role of PKR in palmitate-induced Sirt1 inactivation and endothelial cell senescence[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2018, 315 (3) :H571
　　[3]GAO Z, ZHANG H, LIU J, et al. Cyclooxygenase-2-dependent oxidative stress mediates palmitate-induced impairment of endothelium-dependent relaxations in mouse arteries[J]. Biochem Pharmacol, 2014, 91 (4) :474