探讨在高原体外培养动物心肌细胞的可行性及其生长特性

　　体外动物细胞培养已广泛应用于现代医学、生物学和分子遗传学等多个领域，是从事细胞水平及分子水平研究所采用的基本方法。在高原环境下心肌细胞的体外培养尚未见报道。本文拟通过心肌细胞系的体外培养，观察其生长和增殖状况，并通过绘制生长曲线，初步探讨在高原体外培养动物心肌细胞的可行性和细胞的生长特性，为高原病研究提供实验基础。

　　1 材料方法

　　1.1 研究对象
　　心肌细胞系H9C2(吉林大学一院转化研究院惠赠)。

　　1.2 主要仪器及试剂
　　-80℃低温冰箱（Thermo），台式离心机(德国)；CO2培养箱(Thermo)、恒温水浴箱（上海），倒置相差显微镜（OLYMPUS）；高糖DMEM培养基、台盼蓝(Gibco)、CCK8(碧云天）。

　　1.3 细胞复苏
　　从-80℃冰箱内取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液完全融化；无菌条件下将细胞悬液移入10ml离心管，缓慢加入无血清培养基至10ml，离心（1000r/min，5min），弃上清，重复1次；血清体积分数为0.15的高糖DMEM培养基混沉淀细胞，制成细胞悬液，调整细胞浓度1×108后接种于33mm 塑料培养皿内，放置于59%CO237℃培养箱中培养。

　　1.4 心肌细胞成活率计算
　　细胞培养24h后制备单细胞悬液；采用台盼蓝染色法对活细胞计数。细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合混匀；在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞；活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。

　　1.5 心肌细胞形态学观察
　　采用倒置相差显微镜观察培养细胞形态,了解心肌细胞系生长及增殖情况。细胞接种24h内，每8h观察培养细胞1次，以后为每天早晚各观察培养细胞1次。

　　1.6 细胞计数和生长曲线法检测细胞增殖
　　细胞接种当天计为0d，在培养的1-15d间每天下午16点取3块平皿的细胞用血球计数板进行细胞计数。

　　使用CCK8试剂盒检测细胞增殖情况，调整细胞浓度为1×105后接种于96孔板，每孔加入100μL单细胞悬液，分别在培养的1-15d间，每天取5个孔检测，检测时每孔加入10μLCCK8溶液，细胞培养箱内继续孵育1h，用酶标仪在450nm测定吸光度。

　　2 结果

　　2.1 心肌细胞形态观察
　　心肌细胞最初接种时呈圆形，24h后细胞贴壁生长；4d后细胞有伪足伸出，细胞呈梭形、多角形等形态，大小均匀，生长迅速，7d后细胞逐渐形成细胞簇，11d天后细胞簇相互连接成片生长，融合率达90%时进行传代。
　　
　　2.2 心肌细胞存活率
　　光学显微镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状；计数1000个细胞，蓝染细胞48个，成活率为95.20%。

　　2.3 细胞增殖能力
　　在心肌细胞体外培养的不同时间点，采用CCK8法绘制生长曲线，从图中可见0-1d天内曲线呈现下降趋势，1-7d曲线平缓上升，7-11d曲线急剧上升，11d后曲线逐渐变得平直且有下降趋势。心肌细胞随培养时间延长，数量不断增加，在第5d时细胞数较第1d时增加了3倍，第7d时细胞再次倍增之后细胞进入快速生长时期到第11d时细胞数达到顶峰，以后进入平台期（见表1）。【表1】

　　3 讨论

　　目前我国对高原病细胞水平的研究主要侧重于非高原地区模拟低氧条件的研究。模拟的低氧条件与高原现场环境有很大的差异，例如缺氧持续的时间、全天内不同时段氧分压的细微改变、不同季节氧分压的变化以及温度、湿度等情况都是难以模拟的，所以在高原现场开展细胞水平、分子水平的研究对深入探讨高原病的发病和病理机制较模拟条件下研究更有意义且更加有助于对疾病的认识。

　　本研究在西藏大学高原医学实验中心完成。采用单一样本观察的方法对高原环境体外培养的心肌细胞生长特性进行研究。一般来讲体外培养细胞的生长过程分为潜伏期、对数生长期和平台期三个阶段,本研究中结果显示，心肌细胞在高原条件下的生长曲线也分为三个阶段，第一阶段为潜伏期，该时间段正是细胞处在损伤修复、环境适应和贴壁等过程，所以“生长曲线”从初接种的0d时有下降表现，1d时“生长曲线”趋于平缓，2d时“生长曲线”有上升趋势；从第3d起可见曲线逐步上升说明细胞进入了快速生长期即第二阶段对数生长期，在这一阶段细胞活力旺盛、增殖活跃、数量倍增明显；随着时间的进一步推移从第11d开始曲线逐渐变得平直且有下降趋势即进入第三阶段平台期，这一阶段细胞数量基本维持在恒定水平。从以上三个阶段可以看出高原现场进行细胞培养较以往文献报道的非高原环境培养细胞所需的时间长且细胞生长的各个时段也较非高原地区要长，推断这一现象可能与高原低压低氧有关。培养的第4d细胞数较第2d时增加了1倍，但是此后细胞数目增加缓慢，这表明随着培养时间的延长和细胞数不断地增加，培养基中的营养成份有所不足，可能是由于细胞量的增加导致代谢产物增多，使细胞营养供应不足，我们给细胞更换培养基1d后，细胞数量又出现了快速增长。以此为依据确定了每间隔3d更换一次培养基的操作方法。从细胞数量变化上我们观察到在第10d以后细胞增殖变得缓慢，分析其原因可能是随着细胞的数量的不断增加导致细胞间相互接触而使其处于增殖抑制的状态，我们给细胞进行了传代处理以后，细胞恢复生长。

　　高原环境体外培养心肌细胞，营养成分缺乏和接触抑制作用对细胞增殖是同时存在的影响因素，这与文献报道是一致的。平均海拔3600米的低压低氧高原环境可能是心肌细胞生长周期较非高原地区长的一个重要因素。以上结果表明，高原环境可以进行心肌细胞的体外培养，但高原环境使对细胞器和细胞内的蛋白表达是否有影响有待于进一步研究。

　　参考文献
　　
　　[1] 张明森,李素芝,谢刚,等. 高原现场大鼠肝细胞体外长期培养[J]. 现代预防医学，2007,30 ( 20) : 3998-3999.
　　[2] Wang Q，Wang DJ,Li QG，Zhu LY.Improved method for primary cardiacmyocyte cul ture[J].Zhongguo Zuzhi GongchengYanjiu yu Linchuang Kangfu, 2007,11(6):1168-1169(China).
　　[3] 王涛,余志斌,谢满江,等.新生大鼠心肌细胞培养技巧[J].第四军医大学学报,2003,24(2): 2.
　　[4] 腾伟. 心肌细胞二维培养的纯化和鉴定 [J]. 当代医学,2011,17(11):24-25.
　　[5] 王瑞华,兰晓莉,曾国祥,等. 新生SD大鼠心肌细胞培养方法的简化及改良[J]. 心脏杂志,2008,20(2):154-156.
　　[6] 汪长华. 心肌细胞的培养及注意事项 [J]. 中国心脏起搏与心电生理杂志,2003,17( 3 ): 230 - 232.
　　[7] 杨瑞丰,潘 伟. 心肌细胞培养进展 [J]. 中国心血管病研究杂志，2005,3( 8 ) : 634- 636.